4.5. Експресія (функціонування) чужорідних генів в геномі бактерій, рослин і тварин

В даний час розроблені системи клонування і експресії генів в бактеріях, дріжджах, грибах, клітинах рослин і ссавців. Багато грампозитивних бактерій є суперпродуцентами найважливіших хімічних сполук. Значних успіхів у біоіндустрії вдалося досягти з клітинами Bacillus subtilis, стрептоміцетами і Saccharomyces cerevisiae. Щоб відбулась експресія гену, вектор повинен мати специфічні для даної клітини промотор і термінатори транскрипції, а також сигнал поліаденілірування, для того, щоб еукаріотична РНК-полімераза могла транскрибувати бактеріальну послідовність (і-РНК), а потім і-РНК зв'язувалася з рибосомами (R-сайт) та транскрибувати бактеріальний білок в рослинній або тваринній клітині. Експресію трансгенів забезпечують сильні промотори. Потрібен захист чужого гена від ендонуклеаз, а чужого генного продукту від протеаз. Тому використовують мутантні штами бактерій зі зниженою активністю цих ферментів. Гібридні гени створюються також для забезпечення секреції чужорідного генного продукту з клітини. У E. Coli цю функцію виконує мембранний ліпопротеїн.

Найбільш успішно клонування генів і отримання їх продуктів здійснюється в E. Coli. Однак отримання продуктів з інших груп організмів, особливо еукаріот, в клітинах E. Coli обмежена, оскільки у них відсутний сплайсинг і не відбувається гліколізірування білків (коли молекули набувають свої функціональні і антигенні властивості).

У дріжджів S. cerevisia є сплайсинг, але він відбувається не зовсім так, як у вищих еукаріот, і гени їм потрібно вводити без інтронів. Існує у дріжджів і гліколізірування хоча його функція дещо інша. Вдалося ввести ген лейкоцитарного інтерферону людини в дріжджі і домогтися його експресії, але для цього замінили промоторні і лідерні частини гена на відповідні області алкогольдегідрогенази дріжджів.

Якщо ген вводять в клітини тварин у вигляді позахромосомних елементів, то він легко елімінується, тому ген необхідно вбудувати в хромосому. Клітини з «чужими» генами мають знижену швидкість росту. Це стримує роботи з генної інженерії.

У тварин працюють промотори тільки 4 генів: металотіонеіну, трансферину, імуноглобуліну і еластази. Вони здатні експресувати приєднані до них гени. Якщо бактеріальні гени трансформовані рослинам, то потрібно замінити бактеріальні промотори на промотори рослинних генів або на інші, які можуть ініціювати транскрипцію в рослинній клітині.

В якості промотору для експресії бактеріальних генів найбільш часто використовують промотор 35S-РНК вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV), який забезпечує транскрипцію в геномах як дводольних, так і однодольних рослин, і високий рівень експресії гена, що знаходиться під його контролем. Навіть при трансформації рослинної клітини рослинним геномом часто замінюють його власний промотор на промотор 35S CaMV як більш сильний.

Останнім часом іноді використовують штучно отриманий МАС-промотор, який являє собою подвоєну послідовність 35S CaMV.

Останнім часом все більшого значення набувають також специфічні промотори; гени під їх контролем експресуються тільки в певних тканинах (пататіновий промотор буде експресувати ген тільки в бульбах картоплі). У генної інженерії використовуються індуцібельні промотори, які експресують гени тільки в певних умовах (при пораненої або в присутності іонів металів). Недоліком багатьох тканеспецифічних і індуцібельних промоторів є їх слабка активність.

На експресію трансгену впливає також місце інтеграції його в рослинний геном. Дуже часто т-ДНК вбудовується в гетерохроматинові райони, де експресія гена не буде відбуватися. Ситуацію можна подолати тільки повторними трансформаціями.

Для виявлення експресії чужорідних генів на ранніх стадіях одержання трансгенних рослин використовують маркери експресії - репортерні гени, генні продукти яких легко виявляються. Найбільш широко використовуваний репортерний ген GUS кодує фермент β-глюкоронідазу і при додаванні субстрату розщеплює його з одержанням сполуки, пофарбованої в яскраво-блакитний колір. Інший репортерний ген при експресії утворює флуоресцентний білок, який також легко виявляється.