4.3. Методи трансформації клітин рослин і тварин

Трансформація – це процес переносу генетичної інформації, при якому ДНК, що виділена з клітини-донору, потрапляє у клітину-реципієнту. Трансформація може відбуватися як хромосомною, так і плазмідною ДНК. Процес, при якому в бактеріальні клітини потрапляє виділена ДНК фага і зумовлює утворення в них зрілих фагових часточок, має назву трансфекція.

Мікроорганізми не завжди здатні до трансформації. Трансформуються лише компетентні клітини, які здатні адсорбувати і поглинати ДНК. У багатьох бактерій компетентність виникає лише на певному етапі росту культури – в стадії компетентності.

Один з найважливіших етапів генетичної трансформації – це перенесення молекул ДНК через оболонку клітини. На стан компетентності клітин впливають різні фактори зовнішнього середовища. До них належать температура, рН, іони важких металів, осмотичний тиск та ін..

Компетентні клітини відрізняються від некомпетентних зміною властивостей клітинної оболонки. В них знижений поверхневий заряд, підвищена чутливість до осмотичного шоку. Мікроорганізми, в яких відсутня природна компетентність також можуть бути трансформовані. Для цього клітини оброблюють тім, чи іншим способом, для ініціації в них здатності до поглинання ДНК. Найбільш поширений метод індукції компетентності у клітин Е.соІі – це обробка крижаним розчином СаСІ₂. Використовують також спосіб глибокого заморожування з наступним відтаюванням клітин, що забезпечує збільшення проникності для фагової, плазмідної і хромосомної ДНК. Метод має назву кріотрансформація. Для підвищення проникності клітинних мембран на них впливають електричним струмом. Ця процедура називається електропорація. Умови її проведення різні для різних видів бактерій. При роботі з Е.соІі клітинну суспензію і ДНК розміщують в посудині з зануреними електродами і подають одиничний імпульс струму. Після цього ефективність трансформації покращується до 10⁹ для коротких плазмід (приблизно 3 т.п.н.) і до 10⁶ для великих (приблизно 135 т.п.н.).

Трансдукція – це переніс генетичної інформації від клітини донору до клітини-реципієнту за допомогою фагу.

Однак, нема потреби очікувати коли ДНК фагу буде захоплювати фрагмент чужорідної ДНК для її внесення в клітину-реципієнту, якщо можливо штучно створити рекомбінантну ДНК фагу і використовувати такий фаг в якості вектору (наприклад, для клонування великих фрагментів ДНК). Тем більш, що фаговий вектор вводить рекомбінантну ДНК при зараженні клітини, тобто методом інфекції, що значно ефективніше ніж шляхом трансформації або трансдукції.

В даний час розроблені способи введення генів у ембріональні клітини ссавців, мух і деяких рослин з метою зміни таких властивостей організму, як швидкість росту, стійкість до захворювань і зовнішніх впливів.

Мікроін'єкцію клонованих генів проводять в один або обидва пронуклеуси щойно заплідненої яйцеклітини. Потім яйцеклітину негайно імплантують в яйцепровід матери-реципієнта або дають можливість розвиватися в культурі до стадії бластоцисти, після чого імплантують в матку. Таким образом були ін'єктовані гени інтерферону і інсуліну людини, ген глобіну кролика, ген тімідінкіназного вірусу герпесу і к-ДНК вірусу лейкемії мишей. Виживає зазвичай від 10 до 30% яйцеклітин, а частка мишей, народжених з трансформованих яйцеклітин, становить до 40%. Рівень експресії чужорідного гена залежить від місця інтеграції ДНК з хромосомами, від диференціювання тканин.