Питання для самоперевірки

1. Перерахуйте основні стадії біотехнологічної схеми отримання продуктів мікробного синтезу.

2. Як визначити фізіологічні потреби мікроорганізмів у поживних речовинах?

3. Які методи застосовують для знезараження поживних середовищ в біотехнологічному виробництві?

4. Опишіть послідовність отримання посівного матеріалу для промислового виробництва цільового продукту.

5. Основне призначення ферментера.

6. Від чого залежить проведення стадії виділення цільового продукту?

7. Які методи застосовують для відділення біомаси клітин від культуральної рідини?

8. Що таке дезінтеграція, в яких випадках її здійснюють?

9. Розкажіть про основні методи дезінтеграції клітин.

10. У чому відмінність сепарування від центрифугування?

11. У яких випадках виконується стадія очищення цільового продукту?

12. Що таке сорбція?

4. Методи генетичної інженерії

У новій біотехнології частіше використовуються віруси і бактерії, рослини і тварини та їх клітини, отримані (або поліпшені) з використанням методів генетичної інженерії.

Послідовність генно-інженерних процесів наступна:

1. Отримання генів.

2. Введення гена в вектор і їх клонування.

3. Методи трансформації тваринних і рослинних клітин.

4. Скринінг - відбір бактерій або клітин, в яких вбудований ген.

5. Експресія (функціонування) генів у реципієнта.

6. Виловлювання генних продуктів з «брудної» суміші.

4.1. Методи отримання генів

1. Хімічний синтез. Розшифрувавши послідовність амінокислот у білку і використовуючи генетичний код, визначають послідовність нуклеотидів ДНК на ділянці гена і здійснюють його синтез з нуклеотидів за допомогою ферменту ДНК-полімераза-1. Таким шляхом в 1969 р. Корані вперше синтезував ділянку молекули ДНК, що кодує аланінову т-РНК, а в 1977 р. Бойєр синтезував ген соматостатину людини, а потім і ген інсуліну. У 1977 р. В. Гілбертом, а також Ф. Сенгером був запропонований метод секвенування, тобто розпізнавання послідовності нуклеотидів в фрагментах нуклеїнових кислот. Метод хімічного синтезу генів виявився трудомістким і малоефективним.

Потім з'явилися швидкі і прості методи синтезу порівняно довгих олігонуклеотидів з певною, заздалегідь заданою, послідовністю нуклеотидів. Тепер досить легко можна синтезувати послідовність до 100 нуклеотидів. Автоматизація цих процесів ще більше полегшує і прискорює синтез.

2. Рестрикційний метод, або отримання генів за допомогою специфічних ендонуклеаз – рестриктаз. Ці ферменти відкриті в 1953 р. у бактерій. За допомогою рестриктаз розщеплюють ДНК бактерій іншого штаму або клітини-господаря. До теперішнього часу з різних мікроорганізмів виділено понад тисячі різних рестриктаз; в генетичній інженерії використовується близько 200.

Рестріктази гідролізують ДНК строго по певним специфічним послідовностям, званим сайтами рестрикції. Кожна з рестриктаз дізнається свій сайт рестрикції і розрізає ДНК або всередині сайту, або в безпосередній близькості від нього. Позначення рестриктаз складається з початкових літер латинської назви виду бактерії, з якої виділено фермент, і додаткового позначення, оскільки з бактерій одного виду може бути виділено декілька різних рестриктаз: Escherichia coli - Eco R1, Eco RV; Thermus aguaticus - Tag1.

З декількох типів рестриктаз в генній інженерії часто використовуються рестриктази двох типів, які дізнаються певну послідовність ДНК і гідролізують її всередині послідовності сайту рестрикції. Фрагменти ДНК, що мають однакові «липкі» кінці, можуть з'єднуватися один з одним за допомогою ДНК-лігази, при цьому сайт рестрикції відновлюється. Фрагменти з «липкими» кінцями найбільш зручні для створення рекомбінантних ДНК. Однак рестриктази не «вистригають» повністю ген і його потрібно або добудовувати хімічним шляхом, або відщеплює зайві нуклеотидні послідовності.

3. Ферментативний синтез генів став можливий після відкриття ферменту зворотної транскриптази або ДНК-ревертази (Г. Темін, Мізутані, 1970), виділеної з онкогенних вірусів. Ревертази можуть синтезувати комплементарну ланцюг ДНК (к-ДНК) на РНК-матриці. Для початку реакції синтезу ДНК-ревертазой потрібний запал у вигляді невеликого дволанцюжкового відрізка. Цю функцію виконують короткі олігонуклеотиди з 18-20 тимінових залишків (полі-Т), які з'єднуються за принципом комплементарності з полі-А-послідовністю і-РНК. В результаті утворюється гібридна і-РНК - к-ДНК молекула, причому на кінці у неї буде синтезуватися короткий відрізок дволанцюжкової ДНК – шпилька. Шпилька служить запалом для синтезу другого комплементарного ланцюга ДНК, що здійснюється вже ферментом ДНК-полімеразою (рис. 5).

Рис. 5. Схема синтезу дволанцюгової к-ДНК на м-РНК (і-РНК)

Ланцюг і-РНК гідролізується РНК-азой, а шпилька (одноланцюгова ДНК) – ендонуклеазою S1. В результаті створюється дволанцюгова молекула к-ДНК, що відповідна структурному гену, з якого транскрибувалася вихідна молекула і-РНК. До отриманої ДНК приєднують «липкі» кінці для вбудовування в плазміду і розмноження гена. Подібна схема була використана для одержання генів, що кодують інсулін, гормон росту, інтерферон, альбумін, імуноглобуліни та ін. білки, виробництво яких вже налагоджене в промислових масштабах.

Можливо і з'єднання фрагментів ДНК з «тупими» кінцями за рахунок дії ДНК-лігази, але ефективність такого «зшивання» на порядок нижче. Розроблено методи з'єднання фрагментів ДНК з «липкими» і «тупими» кінцями, що дозволяє створювати рекомбінантні молекули ДНК і в тих випадках, якщо навіть ці фрагменти були отримані з використанням різних рестриктаз.

Під рекомбінантними ДНК розуміють ДНК, утворені об'єднанням in vitro двох і більше фрагментів ДНК, виділених з різних біологічних джерел.

4. Хіміко-ферментативний синтез генів застосовується найбільш часто. Хімічним шляхом синтезують олігонуклеотиди: лінкер, адаптери, праймери, промотори, а гени синтезують ферментативним методом.

Лінкер (англ. «Iink» – з'єднувати) – короткий дволанцюговий олигонуклеотид, що містить сайти впізнавання для ряду рестриктаз.

Адаптери – це лінкери, що містять більше одного сайту впізнавання рестриктазой, він призначений для з'єднання фрагментів з несумісними кінцями.

Праймери – короткі одноланцюгові фрагменти, комплементарні початку або кінцю гена.

Промотор (80…10 нуклеотидів) – фрагмент ДНК, що розпізнається РНК-полімеразою.