Виготовлення поживних середовищ. Стерилізація середовищ та лабораторного обладнання

Дослідження збудника хвороби неможливе без накопичення його біомаси у вигляді:

• колонії на твердому поживному середовищі;

• завісі, плівки або осаду – в рідкому;

• вогнища запалення – в конкретному органі або органах організму лабораторної тварини, до яких збудник має максимальну пристосованість (тропність).

В перших двох випадках для культивування мікроорганізмів потрібно мати стерильні живильні середовища певного складу та консистенції. Такі середовища можна розділяти за різними ознаками. Найчастіше використовують поділ за складом; за консистенцією; за призначенням для виділення певної кількості видів мікробів (табл.1). Всі живильні середовища повинні відповідати таким вимогам:

• мати достатню кількість води та необхідних елементів живлення;

• бути вільним від будь-яких мікроорганізмів (стерильним);

• бути прозорим (для спостереження за ростом мікроорганізмів);

• мати відповідний рівень кислотності. рН середовищ змінюється в залежності від біологічних властивостей досліджуваних мікроорганізмів і коливається в межах 5,0 – 8,5.

Табл.1. Характеристика живильних середовищ.

№ п/п	Ознака	Тип	Характеристика середовища
1	Склад	Природне	Складається з продуктів рослинного або тваринного походження і має невизначений хімічний склад.
		Напів-синтетичне	Складається з продуктів рослинного або тваринного походження та хімічних речовин в певній кількості. Хімічний склад визначено тільки частково.
		Штучне	Складаються тільки з певної кількості хімічно чистих речовин, що розводяться в дистильованій воді.
2	Консис-тенція	Рідке	Компоненти середовищ розчиняються у водопровідній або дистильованій воді.
		Напіврідке	До рідкого середовища додаються загусники: 0,1-0,2% агар-агару* або 5-7% желатину*.
		Тверде	До рідкого середовища додаються загусники: 1,5-2,5% агар-агару* або 10-15% желатину*.
3	Призначення	Загальне	Середовище, на якому ростуть мікроби багатьох видів з одної або різних морфологічних груп .
		Спеціальне	Наявність певних речовин в середовищі призводить до появи специфічних ознак у колоній мікроорганізмів (зміни в середовищі навкруги колонії). Такими речовинами є кро, крохмаль, твін, холестерин яєчних жовтків тощо.
		Диференційно-діагностичне	До складу середовища обов’язково входять барвники. В результаті у певних виді мікробів утворюються кольорові колонії або середовище навкруги колонії змінює забарвлення.
		Елективне	Наявність певних речовин в середовищі дозволяє рости на ньому представникам тільки одного роду.

Найкращим загусником для поживних середовищ є агар-агар – поліцукор, який виділяють з морських водоростей. Дана речовина розплавляється при температурах вищих 45^о С. Після охолодження середовища полімерна структура відновлюється і середовище загусає. Споживати агар-агар, тобто – розривати зв’язки в полімерних ланцюгах здатні тільки окремі види океанських мікроорганізмів. Патогенні і сапрофітні гетеротрофні мікроби, які співіснують з організмом тварин, не мають ферментів для його розщеплення. Тому тверде середовище і після висіву на нього таких мікроорганізмів, і після їх тривалого культивування не змінює густини. Агарові середовища розливають в чашки Петрі та пробірки ( „скошений агар”). Вони використовуються при первинному виділенні мікроорганізмів із патологічного матеріалу та при вирощуванні чистої культури збудника.

На відміну від агар-агару желатина – продукт, який отримують при виварці кісток, складається з амінокислот та поліпептидів рідної довжини. Ці речовини здатні вживати різні види гетеротрофних мікробів. Тому в процесі росту багатьох з них желатина розріджується. Середовища з даним загусником розливають тільки в пробірки і використовують при проведенні біохімічних досліджень.

На будь-який біологічний об’єкт (і мікробні клітини в тому числі) діють фактори середовища, які можна поділити на декілька груп (рис.3). Оптимальними умовами для розвитку мікроба певного виду є такі:

• достатня кількість необхідних поживних речовин,

• відповідний температурний інтервал,

• необхідна кількість кисню;

• певна вологість субстрату, на якому розвивається мікроорганізм;

• рівень опромінення мікробів на середовищі існування не заважає їх росту та розмноженню;

• відсутність токсичних для мікроорганізму речовин.

Фактори середовища

Ф ізичні Хімічні Біологічні

Температура Кислоти, луги Антибіотики

випромінювання солі важких Ме фаги

магнітне поле, миючі засоби

електрострум органічні розчинники

Рис. 3. Перелік факторів середовища.

Один з перелічених факторів або їх сукупність можуть сформувати в середовищі існування мікроорганізмів такі умови, при яких їх розвиток почне уповільнюватись (мікробостатичний ефект) або взагалі припиниться (мікробоцидний ефект).

Остаточне знищення мікроорганізмів (і спорових, і неспорових) на лабораторному обладнанні та в поживних середовищах найчастіше проводиться за допомогою високої температури. Методами, які дозволяють простерилізувати обладнання є:

• тиндалізація. Дробна стерилізація при температурі 95-100^оС. Нагрівання проводиться впродовж 10-20 хв., після чого настає перерва на 10-12 год. Цикл повторюють 3-4 рази. Таким методом стерилізують як поживні середовища, так і лабораторний посуд та інше обладнання.

• автоклавування. Стерилізація при температурі 108-140^оС в спеціальному приладі (автоклаві). Нагрівання проводиться при підвищеному тиску, що збільшує температуру кипіння води. Температура (значення надлишкового тиску) та час стерилізації (від 10 хв. до 2 год.) залежить від виду матеріалу, його відношення до високих температур та ступеню обсіменіння мікроорганізмами. Метод дозволяє отримати стерильні середовища, лабораторний посуд та інше обладнання.

• стерилізація сухим жаром. Стерилізація при температурі 160-180^оС в сушильній шафі. Метод обробки порожнього скляного посуду. Тривалість стерилізації залежить від температури і складає від 2 год. при мінімальній температури до 30 хв. при максимальній.

• фламбірування. Стерилізація металевих предметів в полум’ї при температурі 300-400^оС.

Додатковими методами, які дозволяють зробити стерильними певні види середовищ та обладнання є газова стерилізація при використанні окису етилену, фільтрування рідин та газів крізь дрібнопористі скляні та керамічні фільтри, тканини або полімерні нітро- та ацетат целюлозні мембрани, опромінення обладнання γ- та β-променями на спеціальних установках.