4. Виявлення фосфорної кислоти в складі нуклеопротеїнів

Принцип методу. Метод ґрунтується на взаємодії фосфорної кислоти з молібденовим реактивом із утворенням забарвленої сполуки фосфорної солі – фосфорномолібденовокислого амонію

1 2(NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃

21NH₄NO₃ + (NH₄)₃PO₄х12MoO₃х6H₂O + 6H₂O.

Обладнання та реактиви: Штатив із пробірками, піпетки градуйовані, нагрівач, гідролізат нуклеопротеїнів дріжджів (отриманий у попередньому досліді), молібденовий реактив (7,5 г молібдату амонію ((NH₄)₂MоО₄) розчинити в 100 мл води та додати 100 мл 32 %-ого розчину азотної кислоти з відносною густиною 1,2 (повне розчинення (NH₄)₂MоО₄ відбувається після додавання азотної кислоти)).

Хід роботи. В пробірку внести 1 мл гідролізату, додати 1 мл молібденового реактиву та кип’ятити. Рідина при цьому забарвлюється в лимонно-жовтий колір, а при охолодженні випадає кристалічний осад жовтого кольору, що обумовлений утворенням фосфорномолібденовокислого амонію.

5. Виявлення білків у складі нуклеопротеїнів

Принцип методу. Для підтвердження наявності білків у складі нуклеопротеїнів проводять біуретову реакцію. Ця реакція характерна для сполук, які містять не менше двох пептидних зв’язків. Такі сполуки з наявними пептидними зв’язками (білки) в лужному середовищі утворюють із сульфатом міді (ІІ) забарвлені комплексні сполуки, колір яких залежить від довжини поліпептидного ланцюга. Розчин нативного білка дає синьо-фіолетове забарвлення, а продукти його гідролізу (пептиди) – червоно-фіолетове.

Обладнання та реактиви: Штатив із пробірками, піпетки градуйовані, крапельниця, гідролізат нуклеопротеїнів дріжджів, 10 %-ий розчин гідроксиду натрію, 1 %-ий розчин сульфату міді (ІІ), розчин лакмусу.

Хід роботи. В пробірку внести 0,5 мл гідролізату, нейтралізувати його розчином гідроксиду натрію (значення рН перевірити лакмусом), потім додати 0,5 мл розчину гідроксиду натрію та 2-3 краплі розчину сульфату міді (ІІ). Суміш перемішати й спостерігати появу забарвлення, що свідчить про присутність у пробі поліпептидів, які утворюються в результаті гідролізу білкової частини нуклеопротеїнів.

6. Якісне визначення днк за Діше

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності вуглеводневого компоненту нуклеїнових кислот (рибози або дезоксирибози) давати специфічні кольорові реакції з солянокислим цистеїном.

Обладнання та реактиви: Штатив із пробірками, колба на 50 мл, мікропіпетки, піпетки градуйовані, водяна баня, термометр лабораторний, годинник, 0,01-0,1 %-ий водний розчин натрієвої солі ДНК, 5 %-ий розчин солянокислого цистеїну, розчин сірчаної кислоти (змішати 6 мл води та 15 мл концентрованої кислоти).

Хід роботи. В пробірку внести 1 мл розчину ДНК, додати 0,04 мл розчину солянокислого цистеїну та 5 мл розчину сірчаної кислоти. Суміш нагріти на водяній бані при температурі 40° С упродовж 5 хв. При цьому вміст пробірки забарвлюється в рожевий колір, який не зникає впродовж декількох годин.

7. Визначення вмісту днк за Броді

Принцип методу. Інтенсивність забарвлення дезоксирибози молекули ДНК із солянокислим цистеїном залежить від вмісту ДНК у розчині. Цим методом можна визначати вміст ДНК у розчинах, які містять від 1 до 10 мкг ДНК.

Обладнання та реактиви: Штатив із пробірками, піпетки градуйовані, водяна баня, спектрофотометр, досліджуваний розчин ДНК (із вмістом 1-10 мкг речовини), 1 %-ий розчин солянокислого цистеїну, концентрована сірчана кислота.

Хід роботи. В пробірку внести 0,5 мл досліджуваного розчину ДНК, додати сюди 0,05 мл розчину солянокислого цистеїну й суміш охолодити впродовж 10 хв. у холодній воді. Потім додати 5 мл охолодженої концентрованої сірчаної кислоти. Вміст пробірки перемішати й поставити на водяну баню при температурі 25° С на 20 хв. Оптичну густину забарвленого розчину визначити на спектрофотометрі при довжині хвилі 474 нм.

КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ

1. Вміст, знаходження та склад нуклеїнових кислот.

2. Будова нуклеотиду.

3. Види та біологічна роль нуклеїнових кислот.

4. Первинна структура нуклеїнових кислот.

5. Вторинна структура ДНК, її форми.

6. Третинна структура ДНК.

7. Характеристика різних типів РНК.

8. Властивості нуклеїнових кислот.

9. Принципи методів визначення складових компонентів нуклеїнових кислот.

10. Принципи методів визначення ДНК за Діше та Броді.