3. Визначення активності каталази методом о.М. Баха та а.І. Опаріна

Принцип методу. Каталаза (К.Ф. 1.11.1.6) – фермент, який каталізує реакцію розкладу пероксиду водню на воду й молекулярний кисень. Незначною мірою вона також сприяє окисленню різних спиртів і інших сполук пероксидами. Цей фермент досить широко розповсюджений у рослинних тканинах і є тут одним із найактивніших.

Активність каталази визначають за кількістю пероксиду водню, що розклався під дією ферменту. В реакційну суміш вносять надлишок пероксиду водню. В контрольному зразку каталазу інактивують сірчаною кислотою. В досліджуваному зразку частина внесеного пероксиду водню розкладається під дією ферменту, а ту частину, що не розклалася, визначають титруванням перманганатом калію в кислому середовищі. При цьому відбувається така реакція

5 Н₂О₂ + 2КМnО₄ + 3Н₂SО₄ 2МnSО₄ + К₂SО₄ + 5О₂ +

+ 8Н₂О.

Об’єм пероксиду водню, що розклався під дією ферменту у відповідності до приведеної реакції, знаходять за різницею між дослідним і контрольним титруваннями.

Обладнання та реактиви. Технохімічні ваги, центрифуга, термостат, годинник, ступки фарфорові з товкачиком, мірні циліндри, пробірки центрифужні, хімічний стакан на 50 мл, конічні колби на 200 мл, бюретки, піпетки градуйовані, шпатель, термометр лабораторний, годинник, 0,1 н розчин пероксиду водню (Н₂О₂), 10 %-ий розчин сірчаної кислоти, 0,1 н розчин перманганату калію (КМnО₄), карбонат кальцію, дистильована вода, індикаторні папірці, кварцовий пісок, рослинний матеріал.

Хід роботи: На технохімічних вагах відважити 2-3 г свіжого рослинного матеріалу та розтерти його в ступці з кварцовим піском. Якщо реакція рослинного матеріалу кисла (визначити за допомогою індикаторних папірців), то в ступку додати на кінчику шпателя невелику кількість карбонату кальцію. В процесі розтирання в ступку невеличкими порціями додати точно 40 мл води. Розтерту масу кількісно (змити ступку 10 мл дистильованої води) перенести в центрифужні пробірки та відцентрифугувати 10-15 хв. при 3-5 тис. об./хв. Потім надосадову рідину з центрифужних пробірок перелити в хімічний стакан.

Для визначення активності ферменту зі стакану взяти дві проби по 20 мл ферментної витяжки та перенести їх у конічні колби на 200 мл. В одну з колб, яка служить контролем, долити 5 мл розчину сірчаної кислоти для інактивації ферменту. Потім в обидві колби додати по 20 мл розчину пероксиду водню. Реакцію розкладання пероксиду водню проводять при 20⁰ С впродовж 30 хв. Після додавання кожного з реактивів уміст колб старанно перемішати. Через 30 хв. фермент у досліджуваній колбі інактивувати додаванням у неї 5 мл розчину сірчаної кислоти.

Потім надлишок перекису водню в кожній колбі відтитрувати розчином перманганату калію до утворення стійкого рожевого забарвлення, що не зникає впродовж 1 хв.

Активність каталази (Е) виразити в мікромолях пероксиду водню, що розклався під дією ферменту за 1 хв. у розрахунку на 1 г свіжого рослинного матеріалу. Розрахунок провести за формулою

(V_k - V_e) · Т · 50 · 50

E = —————————— ,

m · 20 · 30

де V_k – об’єм 0,1 н розчину КМnО₄, витраченого на титрування контрольного зразка, мл; V_e – об’єм 0,1 н розчину КМnО₄, витраченого на титрування досліджуваного зразка, мл; Т – поправка на титр 0,1 н розчину КМnО₄; 50 – коефіцієнт перерахунку на мікромолі Н₂О₂; 50 – загальний об’єм екстракту, мл; 20 – об’єм ферментного розчину, взятого для аналізу, мл; 30 – час ферментативної реакції, хв.; m – наважка матеріалу, взятого для аналізу, г.