6. Ксантопротеїнова реакція

Принцип методу. В ароматичних амінокислотах, які містять бензольні кільця (тирозин, триптофан, фенілаланін), під дією азотної кислоти відбувається реакція нітрування бензольного кільця з утворенням забарвленої в жовтий колір нітросполуки.

У реакції гідроксиду натрію з хіноїдною формою динітротирозину утворюється натрієва сіль динітротирозину, що має оранжевий колір.

Обладнання та реактиви: Штатив із пробірками, піпетки градуйовані, спиртівка, пробіркотримач, 1 %-ий водний розчин тирозину, концентрована азотна кислота, 10 %-ий розчин гідроксиду натрію.

Хід роботи. В пробірку внести 3 мл розчину тирозину та 1 мл концентрованої азотної кислоти. Суміш обережно нагріти в полум’ї спиртівки до появи жовтого забарвлення. Після охолодження в пробірку додати розчину гідроксиду натрію до появи оранжевого забарвлення.

7. Мікрометод визначення амінного азоту мідним способом

Принцип методу. Цей мікрометод визначення амінного азоту мідним способом був розроблений Войвудом і модифікований Т.А. Глаголєвою. Принцип методу полягає в тому, що амінокислоти реагують із солями міді з утворенням розчинного мідного комплексу. Надлишок міді видаляють із розчину та визначають вміст міді в розчині або йодометричним методом, або за допомогою діетилдитіокарбомату натрію, що кількісно розкладає мідні сполуки амінокислот, даючи при цьому жовте забарвлення. Оптичну густину забарвленого розчину визначають колориметрично. Лінійна залежність між вмістом більшості амінокислот спостерігається в межах від 1 до 30 мікрограмів амінного азоту.

Обладнання та реактиви: Ваги технохімічні, фарфорова ступка з товкачиком, штатив із пробірками, лійка, фільтр, хімічний стакан, мірні циліндри, колби мірні на 1 л, 500 і 100 мл, піпетки градуйовані, пробірки градуйовані, скляні палички, водяна баня, центрифуга, ФЕК, 2,73 %-ий розчин хлориду міді (ІІ), 2,56 %-ий розчин гідроортофосфату натрію (25,6 г Na₂HPO₄ розчинити у воді та довести об’єм до 1 л), 1 н розчин гідроксиду натрію, 2 %-ий розчин диетилдитіокарбомату натрію, аміловий або бутиловий спирт, 50 %-ий і 2 %-ий розчини трихлороцтової кислоти, дистильована вода, рослинний матеріал.

Хід роботи. Наважку свіжих листків або інших вегетативних органів рослин масою 5-10 г зафіксувати киплячим аміловим або бутиловим спиртом і ретельно розтерти в ступці. Потім наважку перенести в хімічний стакан на 100 мл. Ступку змити невеликими порціями води (загальний об’єм суспензії в стакані не повинен перевищувати 40 мл). Стакан із суспензією нагрівати на киплячій водяній бані впродовж 1 год.

При аналізі борошна взяти наважку близько 5 г, перенести її в хімічний стакан, залити 40 мл води, ретельно перемішати та витримати на водяній бані при 40-50⁰ С упродовж 1 год., періодично помішуючи скляною паличкою.

Потім провести осадження білків додаванням у хімічний стакан 5 мл 50 %-ого розчину трихлороцтової кислоти. Вміст стакана відфільтрувати в мірну колбу на 100 мл, осад на фільтрі промити 20 мл 2 %-ого розчину трихлороцтової кислоти, вміст колби довести водою до мітки та перемішати.

У пробірку внести 1 мл досліджуваного розчину, що містить 10- 60 мкг амінного азоту, додати 2,5 мл розчину гідроортофосфату натрію та 2,5 мл суспензії фосфорнокислої міді. Паралельно приготувати контрольну пробу, в якій у пробірку замість досліджуваного розчину додати 1 мл води. Суспензію фосфорнокислої міді отримати наступним чином. Спочатку готують розчин ортофосфату натрію (Na₃PO₄), для чого розчинити 25,6 г Na₂HPO₄ в 500 мл дистильованої води, додати 180 мл 1 н розчину NaОН і довести об’єм водою до 1 л. До одного об’єму одержаного розчину Na₃PO₄ додати один об’єм розчину хлориду міді (ІІ) (27,3 г CuCl₂ розчинити в 1 л) і суміш добре перемішати. Після цього долити чотири об’єми 2,56 %-ого розчину Na₂HPO₄ і нагрівати зі зворотнім холодильником упродовж години. Суспензію фосфорнокислої міді необхідно готувати не менш як за 24 год. до її використання; строк зберігання 1-2 місяці.

Після додавання суспензії фосфорнокислої міді суміш у пробірках добре збовтати та залишити на 30 хв. (за цей час проходить реакція між міддю та амінокислотами). Потім видалити залишок міді. Для цього рідину відфільтрувати через щільний фільтр у чисту суху пробірку або відцентрифугувати при 10 тис. об./хв. упродовж 15 хв., що забезпечує повне видалення з розчину слідів осаду фосфорнокислої міді, котра може вплинути на результати.

Після видалення міді половину фільтрату або 3 мл надосадової рідини перенести в градуйовану пробірку. Рідину в пробірці долити водою до 8 мл, додати 0,1 мл 2 %-го розчину діетилдитіокарбомату натрію, довести водою до 10 мл і добре перемішати. При цьому з’являється жовте забарвлення.

Після 10-хвилинного витримування сполуку, що дає жовте забарвлення, екстрагувати 10 мл амілового або бутилового спирту. Суміш відцентрифугувати при 10 тис. об./хв. упродовж 15 хв. і оптичну густину одержаного жовтого розчину визначити на ФЕКу з синім світлофільтром. Паралельно визначити оптичну густину контрольної проби, в якій замість розчину, що досліджується, була прилита вода.

Вміст амінного азоту визначити за знайденою величиною оптичної густини, використовуючи калібрувальну криву.

При розрахунках величину оптичної густини контрольного розчину віднімають від величини оптичної густини досліджуваного розчину.

КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ

1. Поняття про амінокислоти, їх різноманітність у рослинних організмах.

2. Класифікація амінокислот.

3. Хімічна будова основних протеїногенних амінокислот.

4. Фізико-хімічні властивості амінокислот.

5. Загальні хімічні властивості амінокислот.

6. Якісні реакції на амінокислоти.

7. Принцип мікрометоду визначення вмісту амінного азоту мідним способом у рослинному матеріалі.