2. Отримання спиртового розчину (витяжки) пігментів
Принцип методу. Як правило, пігменти з рослинних тканин вилучають органічними розчинниками (етиловий спирт, ацетон, бензол), які руйнують зв’язок хлорофілів і ксантофілів із ліпопротеїнами пластид і тим самим забезпечують їх повне екстрагування. Неполярні розчинники (петролейний ефір, гексан, бензин та ін.) не порушують зв’язку цих пігментів із білками й тому не можуть їх вилучати зі свіжих листів. Для одержання витяжки пігментів використовують як сирий, так і сухий рослинний матеріал. В останньому випадку висушені листки попередньо обробляють гарячою водою, щоб полегшити наступне вилучення пігментів.
Обладнання та реактиви: Конічна колба на 200 мл із корком і зворотнім холодильником, колби конічні на 100 мл, мірний циліндр, водяна баня, годинник, 96 %-ий етиловий спирт, дистильована вода, сухі листки кропиви.
Хід роботи. Сухі листки кропиви помістити в конічну колбу та ошпарити окропом, потім воду злити. В колбу долити 100 мл етилового спирту, закрити її корком із зворотнім холодильником і поставити на водяну баню з киплячою водою для екстрагування пігментів. Після п’ятихвилинного кип’ятіння вміст колби охолодити й розчин обережно злити в іншу колбу. Екстракт використати в наступних дослідах.
3. Розподіл пігментів за Краусом
Принцип методу. Метод ґрунтується на різній розчинності пігментів у спирті та бензині. Зазначені розчинники в одній посудині не змішуються, а утворюють дві фази – верхню бензинову та нижню спиртову, завдяки чого розділяються компоненти суміші пігментів.
Обладнання та реактиви: Штатив із пробірками, корок, піпетки градуйовані, крапельниця, бензин, етиловий спирт, дистильована вода.
Хід роботи. В пробірку внести 2-3 мл спиртового екстракту пігментів і додати 3-4 мл бензину. Вміст пробірки сильно струсити, попередньо закривши її корком або великим пальцем, і залишити відстоятися. В міру розшарування емульсії бензиновий шар буде забарвлюватися в зелений колір через кращу розчинність у ньому хлорофілів. У бензин переходить також каротин, але його забарвлення маскується забарвленням хлорофілу. Ксантофіл залишається в спиртовому шарі та надає йому золотисто-жовтого забарвлення.
Якщо пігменти розділяються недостатньо чітко, то слід додати три-чотири краплі води та знову струсити. При надлишку води можливе помутніння нижнього шару. В цьому випадку варто долити невеликий об’єм етилового спирту та збовтати вміст пробірки.
4. Омилення хлорофілу лугом
Принцип методу. Діючи на хлорофіл лугом, можна викликати омилення ефірних груп, тобто відщеплення залишків метилового спирту та фітолу
COOC20H39
M
gN4OH30C32
+
2
NaOH
СООСН3
COONa
M gN4OH30C32 + C20H39OH + СН3OH.
СООNa
Сіль хлорофілінової кислоти, що утвориться при цьому, зберігає зелене забарвлення та оптичні властивості хлорофілу, однак відрізняється від нього більшою гідрофільністю.
Обладнання та реактиви: Штатив із пробірками, піпетки градуйовані, крапельниця, корок, водяна баня, 20 %-ий розчин гідроксиду натрію, бензин, дистильована вода.
Хід роботи. В пробірку з 2-3 мл спиртового розчину пігментів долити 1 мл розчину гідроксиду натрію та збовтати вміст пробірки. Після змішування екстракту з лугом пробірку поставити на киплячу водяну баню. Як тільки розчин закипить, пробірку вийняти та охолодити. До охолодженого розчину додати 3-4 мл бензину та декілька крапель води для кращого розподілу суміші. Потім вміст пробірки різко струсити та дати відстоятися. При цьому в бензиновий шар переходять каротин і ксантофіл, а в спиртовий – натрієва сіль хлорофілінової кислоти.