Техника выполнения

Щелочной гидролиз. Экстракции жирорастворимых витаминов из образца продукта предшествует щелочной гидролиз, что вызвано необходимостью удаления жиров и гидролиза эфиров токоферолов и ретинола. Щелочной гидролиз проводят в присутствии антиоксиданта.

Навеску образца, величина которой зависит от предполагаемого содержания витаминов в продукте (для витамина А – навеска 1...20 г с содержанием витамина 2...25 мкг, для витамина Е – навеска 1...15 г с содержанием витамина 20... 100 мкг, для (β – каротина – навеска 1...15 г с содержанием (β – каротина 10...50 мкг), берут с точностью до 0>01 г, помещают в круглодонную колбу, соединенную шлифом с обратным холодильником, добавляют 40...60 см³ этилового спирта и 0,2 г аскорбиновой кислоты. При анализе сухих продуктов перед внесением этилового спирта к навеске добавляют воду в двукратном количестве, тщательно перемешивают материал стеклянной палочкой и оставляют на 15 мин, периодически помешивая. Затем в колбу вносят 50 % раствор КОН, количество которого зависит от вида продукта, количества и состава в нем жира. При анализе продуктов с низким содержанием жира (менее 6 %) на 10 г образца добавляют 2...4 см³ щелочи. При более высоком содержании жира в продукте (6...40 %) количество добавляемой щелочи численно равно величине навески. Для продуктов с высоким содержанием жира (>40 %) (масло сливочное и др.) на навеску образца 3...5 г берут 4…8 см³ щелочи.

После добавления щелочи смесь кипятят 30 мин на водяной бане с обратным водяным холодильником, охлаждают, переливают в делительную воронку и добавляют воду до окончательной концентрации спирта около 30...35 %. Признаком полного омыления служит то, что после добавления воды смесь остается прозрачной. При образовании мути необходимо повторить омыление с новой навеской, увеличив количество щелочи для омыления.

Смесь после омыления экстрагируют диэтиловым эфиром 4 раза: сначала объемом, равным объему добавленной воды, а затем объемами на 20 % меньшими. Колбу после омыления ополаскивают эфиром. Объединенный эфирный экстракт отмывают от щелочи водой, контролируя рН по фенолфталеину. К экстракту добавляют 8...10 г безводного Na₂S0_4; выдерживают 20...30 мин в темном месте и медленно фильтруют через слой безводного Na₂S0₄ в круглодонную колбу, промывая Na₂S0₄ и фильтр эфиром. Затем весь эфир отгоняют под вакуумом на ротационном испарителе при температуре не выше 25...30 ⁰С, причем последние капли эфира лучше удалять с помощью продувки азотом. Сухой неомыляемый остаток немедленно растворяют в 5... 10 см³ гексана или в объеме растворителя, используемого в качестве подвижной фазы, с тем чтобы концентрация витамина А была в пределах 3...5 мкг/мл, витамина Е – 15...25 мкг/мл. При содержании в анализируемом продукте стеринов в экстракте по мере охлаждения выпадает осадок, вначале в виде хлопьев. В этом случае экстракт необходимо поставить в ледяную баню и оставить на 1...2 ч в холодильнике до полного выпадения осадка. Прозрачный экстракт в охлажденном состоянии осторожно сливают в другую пробирку.

Определение витамина А: Для приготовления стандартного раствора взвешивают 0,0200 г ретинола или 0,0250 г ацетата витамина А с точностью до 0,0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см³ (основной стандартный раствор). В мерную колбу на 100 см³ переносят 2 см³ раствора и доводят объем этиловым спиртом (рабочий стандартный раствор). Содержание витамина А в рабочем растворе в пересчете на ретинол – приблизительно 4...4,5 мкг/мл (13...15 МЕ/мл).

При использовании в качестве стандарта раствора ацетата витамина А в масле навеску препарата рассчитывают исходя из требуемой концентрации рабочего раствора. Стандартный раствор хранят при +4 ⁰С в течение 10 дней. В день использования определяют концентрацию в рабочем стандартном растворе, измеряя оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 324 нм в кювете с длиной I = 1 см и проверяя чистоту стандартного раствора хроматографически (на хроматограмме должен присутствовать один пик витамина, помимо пиков не удерживаемых на колонке примесей, содержащихся в растворителе).

Расчет:

Содержание витамина А в мкг/мл рассчитывают по формуле:

,

где: D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 324 нм относительно этилового спирта;

1000 – содержание витамина А в 1 мл 1 % раствора, мкг;

При использовании в качестве стандарта ацетата витамина А содержание в растворе пересчитывают на витамин А (ретинол) по формуле:

,

где: 0,87 – коэффициент пересчета на ретинол.

При использовании в качестве стандарта ацетата витамина А к навеске образца одного из исследуемых продуктов добавляют точный объем рабочего стандартного раствора ацетата витамина А (навеска образца должна быть равна навеске образца без добавления стандартного раствора). Затем навеску образца с добавленным стандартным раствором подвергают щелочному гидролизу и проводят экстракцию так же, как описано выше для навески испытуемого образца. Сухой неомыленный остаток растворяют в том же объеме растворителя.

В этом случае навеску образца, объем рабочего стандартного раствора, добавляемого к навеске, объем растворителя для растворения неомыляемого остатка рассчитывают исходя из того, что приблизительная концентрация витамина в испытуемом растворе должна быть около 3 мкг/мл, в растворе образца с добавленным стандартным раствором около 5 мкг/мл.

При использовании обращеннофазовой хроматографии придерживаются следующих условий анализа:

• объем проб, вводимый в колонку – 10 мкл;

• состав подвижной фазы метанол – вода (98:2) или ацетонитрил-вода (95:2) в объемных %;

• скорость подачи подвижной фазы – 100 мкл/мин для микроколоночного хроматографа «Милихром» и 1,0 мл/мин для стандартных жидкостно-хроматографических систем.

• в качестве неподвижной фазы рекомендуются колонки с сорбентом на основе силикагеля с привитыми октадецильными группами (ОДС или С₁₈); Силасорб С₁₈, размер частиц – 5...7 мкм.

• типовой размер колонок – 62x2 мм или 80x2 мм для микроколоночного хроматографа; колонки Ultrasphere ODS (250x4,6 мм); Nucleosil С18 (250x4,6 мм) – для стандартного хроматографа;

• детекторы. Определение витамина А проводят с использованием ультрафиолетового (А. = 324 нм) или флуориметрического (α₁ = 324, α₂ = 480 нм) детекторов.

• время удерживания ретинола должно находиться в пределах 3...5 мин, если оно находится в больших пределах, то при приготовлении элюента следует увеличить в нем количество метилового спирта или ацетонитрила на 1 %. Если не удалось добиться нужной элюирующей силы подвижной фазы, добавляют еще 1 % модифицирующего растворителя. И так повторяют, пока не добьются нужного результата. Если же время удеживания находится в меньших пределах, то при приготовлении' элюента аналогично увеличивают количество воды.

При использовании нормальнофазовой хроматографии придерживаются следующих условий анализа:

• состав подвижной фазы смесь гексана или гептана с небольшим содержанием изопропанола (1... 1,5 %) или метанола (0,5...1 %).

• колонки с сорбентом на основе силикагеля различных марок – «Силасорб», «Сепарон», «Партисил», «Зорбакс» и др.

• время удерживания ретинола в этих условиях должно составлять 8...15 мин.

• детекторы. Определение проводят с использованием ультрафиолетового (X = 326 нм) или флуориметрического (к₁ = 324, к₂ = 480 нм) детектора.

• Идентификация. В инжектор жидкостного хроматографа вводят последовательно равные объемы испытуемого и стандартного растворов. Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют путем сравнения со временем удерживания пика витамина на хроматограмме стандартного раствора.

Расчет:

Содержание витамина А в продукте (мг/100 г) определяют по результатам двух хроматографических анализов, его рассчитывают по формуле:

,

где: Н_ис – средняя высота (или площадь) пика витамина на хроматограмме пробы испытуемого раствора, мм или мм²;

Н_ст – средняя высота (или площадь) пика витамина на хроматограмме стандартного раствора, мм или мм²;

С_ст – количество витамина в растворе стандарта, введенного в колонку, мкг;

V₁ – общий объем испытуемого раствора, мл;

V₂ – объем испытуемого раствора, вводимый в колонку хроматографа, мл;

α – навеска образца пищевого продукта, г;

100 – пересчет на 100 г пищевого продукта;

1000 – пересчет на мг.

Результаты определений рассчитывают до третьей значащей цифры. За результат измерения принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.

Определение витамина Е. Для определения массовой доли витамина Е (суммы, α– β–, ᵞ–, ʸ–токоферолов) экстракт токоферолов после щелочного гидролиза вводят в детектор жидкостного хроматографа. Количественное определение проводят по интенсивности поглощения или флуоресценции.

Приготовление стандартного раствора α-токоферола. Для приготовления стандартного раствора взвешивают 0,0400 г α-токоферола с точностью до 0,0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см³. Срок годности данного раствора при температуре +4°⁰С – 10 дней.

Приготовление рабочего стандартного раствора α-токоферола. В мерную колбу на 100 см³ переносят 5,0 см³ раствора и доводят этиловым спиртом до метки. Срок годности данного раствора при температуре +4°⁰С – 10 дней.

Приготовление рабочего стандартного раствора на основе α-токоферилацетата. При использовании в качестве стандарта α-токоферилацетата его подвергают щелочному гидролизу. Взвешивают 0,0400 г α-токоферилацетата с точностью до 0,0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см³. К 5 мл полученного раствора добавляют 15 см³ этилового спирта, 0,1 г аскорбиновой кислоты, 1 см³ 50 % раствора КОН, кипятят 15...20 мин на водяной бане с обратным водяным холодильником и экстрагируют.

После отгонки эфира остаток растворяют в 100 см³ абсолютного спирта (рабочий стандартный раствор). В день использования в рабочем стан­дартном растворе определяют концентрацию α-токоферола, измеряя оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 292 нм в 1 см:

,

где:

D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 292 нм, в кювете сравнения – этиловый спирт;

1000 – содержание α-токоферола в 1 мл 1 % раствора, мкг;

В рабочем стандартном растворе содержание α-токоферола должно быть около 20 мкг/мл.

Чистоту стандартного раствора проверяют спектрофотометрически (максимум при 292...294 нм) и хроматографически (на хроматограмме один пик, помимо пиков не удерживаемых на колонке примесей, содержащихся в растворителях).

Условия хроматографического анализа для метода обращенно-фазовой хроматографии:

• микроколоночный хроматограф «Милихром»,

• микроколонка (62x2 мм или 80x2 мм) с сорбентом «Силасорб» С₁₈;

• объем пробы, вводимый на колонку, 10 мкл;

• подвижная фаза – 98 % водный раствор метилового спирта или 95 % водный раствор ацетонитрила;

• скорость подачи подвижной фазы – 100 мкл/мин. Определение α–токоферола проводят с использованием ультрафиолетового (А = 292 нм) или флуориметрического детекторов. Время выхода α-токоферола должно находиться в пределах 9...15 мин. Для определения суммы Р, α-токоферолов необходимо наличие стандартных растворов этих форм.

Условия хроматографического анализа для метода нормально-фазовой хроматографии:

• микроколонки с силикагелем марки «Силасорб»;

• подвижная фаза гексан или гептан с небольшим содержанием изопропанола (1...1,5 %) или метанола (0,5...1 %),

• время выхода из колонки α-токоферола – в пределах 3...5 мин.

При определении только токоферолов при наличии в экстракте ретинола необходимо проводить элюирование до выхода пика ретинола из колонки, иначе при повторном анализе он будет мешать при определении токоферола.

При совместном определении витамина А и Е детектирование следует проводить в двухволновом режиме (292 и 324 нм) детектирования. Кроме того, в условиях нормально-фазовой хроматографии разные формы витамина Е разделяются на отдельные пики, т.е. может быть получено четкое разделение 8 форм (4 токоферола и 4 токотриенола). В связи с этим необходимы стандартные растворы этих форм для их идентификации.

Проведение хроматографического анализа заключается в том, что в колонку жидкостного хроматографа вводят последовательно равные объемы испытуемого и стандартного растворов. Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют путем сравнения со временем удерживания пика витамина на хроматограмме стандартного раствора. Содержание витамина в образце определяют по результатам двух хроматографических анализов.

Расчет:

Содержание токоферола в образце в мг на 100 г продукта определяют по формуле:

,

где: D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 292 нм, в кювете сравнения – этиловый спирт;

1000 – содержание α-токоферола в 1 мл 1 % раствора, мкг;

Вычисления проводят до третьей значащей цифры. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение (X) результатов двух параллельных определений.

Определение β-каротина следует проводить в условиях нормально–фазовой ВЭЖХ на сорбентах типа «Силасорб», «Сепарон», «Нуклеосил» и других с размером частиц 5 мкм на микроколонках 62x2 или 80x2 мм. Подготовку образцов и стандартных растворов выполняют аналогично, как для витаминов А и Е.

• Подвижная фаза – гексан или гептан с небольшим содержанием (0,1 %) 2–пропанола.

• Оптимальный расход подвижной фазы составляет 100 мкл/мин,

• объем вводимой пробы – 5 мкл,

• аналитическая длина волны – 450 или 480 нм (детектор видимой области спектра), скорость движения диаграммы самописца – 0,3 см/мин. Если в наличии имеется только УФ – детектор, в качестве аналитической применяют длину волны 290 нм.

В условиях стандартной ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором, имеющим сменные фильтры, оптимальным является фильтр с длиной волны 436 нм. В этом случае можно использовать обращенно-фазовую ВЭЖХ на сорбенте «Силасорб» С₁₈, 5... 10 мкм, размер колонки – 250x3 мм, с элюентом состава метанол – ацетонитрил – хлороформ (47:47:6), расход элюента – 1 мл/мин. Время анализа – 15 мин.

Работа 2.2.3. Определение витаминов А и Е фотометрическим методом

Определение содержания ретинола-ацетата (витамина А) и токоферола-ацетата (витамина Е) ведут фотометрическим методом по ГОСТ Р 52147-2003 «Белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки». Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром, разделении витаминов хроматографией на колонке с окисью алюминия и количественном определении витаминов фотометрическим методом.

Реактивы и материалы:

Жировой продукт, витамин E, этиловый спирт, хлорное железо, калия гидроокись, натрий сернокислый, алюминия окись, эфир петролейный, эфир диэтиловый фармакопейный, пирогаллол, спирт этиловый, фенантролин, аскорбиновая кислота, фенолфталеин, вода дистиллированная.

Химическая посуда и оборудование:

Весы, спектрофотометр, фотоэлектро-колориметр, холодильник, балон с азотом, испаритель, водяная баня, термометр, муфельная печь, секундомер, фарфоровые чашки, щипцы для тиглей, лампа ультрафиолетовая, шкаф сушильный, стеклянный холодильник, конические колбы, мерные колбы, делительные воронки, мерные цилиндры, воронки для фильтрования, пипетки с одной отметкой, пипетки градуированные, пробирки мерные с притертыми пробками, склянки из темного стекла, колбы с тубусом, колбы круглодонные, колбы стеклянные для хромотографии, экскикатор, фильтровальная бумага, вата обезжиренная, палочки деревянные.

Приготовление раствора хлорного железа массовой долей около 0,2 % в абсолютированном спирте. Навеску реактива массой 0,2 г растворяют в 99,8 см³  абсолютированного этилового спирта. Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.

Приготовление раствора фенантролина или, дипиридила массовой долей около 0,5 % в абсолютированном этиловом спирте. Навеску реактива массой 0,500 г растворяют в 99,5 см³ абсолютированного этилового спирта. Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.

Приготовление безводного сернокислого натрия. Реактив высушивают в сушильном шкафу при температуре (105 ± 2) ⁰С в течение 3 ч, хранят в склянке с притертой пробкой.

Приготовление окиси алюминия. Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (400 ± 10) ⁰С в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 97 г реактива добавляют 3 см дистиллированной воды и тщательно перемешивают. После отстаивания в течение не менее 3 ч реактив годен к использованию. Реактив хранят в склянке с притертой пробкой.

Приготовление раствора α-токоферола массовой концентрации 1 мг/см³. Навеску токоферола-ацетата массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см³ добавляют от 100 до 200 мг аскорбиновой кислоты, 50 см³ этилового спирта и 10 см³ раствора гидроокиси калия массовой долей 50 %. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в водяной бане при температуре (85 ± 2) ⁰С в течение 25 мин. Затем содержимое колбы быстро охлаждают под струей водопроводной воды до комнатной температуры, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см³, приливают по 50 см³ дистиллированной воды и диэтилового эфира, встряхивают и отстаивают до разделения слоев. После расслаивания нижний водно-спиртовый слой сливают в коническую колбу, а эфирный слой оставляют в делительной воронке. В коническую колбу приливают 50 см³ диэтилового эфира, встряхивают, отстаивают и после расслаивания верхний эфирный слой присоединяют к эфирному экстракту в делительной воронке, а к водно-спиртовому слою в конической колбе снова приливают 50 см³ диэтилового эфира и проводят экстракцию, как было указано выше. После расслаивания эфирный слой из конической колбы снова присоединяют к экстракту в делительной воронке. Объединенные эфирные экстракты промывают дистиллированной водой порциями по 30 см³ до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см³, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (10…15 г). После окончания фильтрации сернокислый натрий три раза промывают порциями (по 20…30см) диэтилового эфира. Эфир отгоняют в водяной бане при температуре не выше 50 ⁰С в токе азота или под вакуумом, используя водоструйный насос или роторный испаритель. К сухому остатку приливают 10…15 см³ абсолютированного этилового спирта, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят объем в колбе до метки этим же спиртом и тщательно перемешивают.

Приготовление раствора α-токоферола массовой концентрации 20 мкг/см³. 1 см³ раствора α-токоферола массовой концентрации 1 мг/см³ переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят объем в колбе абсолютированным спиртом до метки и тщательно перемешивают. В полученном растворе проверяют массовую концентрацию α-токоферола и его чистоту, снимая спектр в пределах 260–310 нм на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно абсолютированного этилового спирта. Чистый α-токоферол имеет симметричный пик максимумом поглощения при длине волны 292 нм. Массовую концентрацию α-токоферола в растворе C_E, мкг/см³, вычисляют по формуле:

,

где: D – оптическая плотность раствора при длине волны 292 нм;

10⁶ – коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

E^1%_1cм – оптическая плотность раствора α-токоферола в абсолютированном этиловом спирте массовой концентрации 1 г в 100 см³ при длине волны 292 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см.

Построение градуировочного графика для определения токоферола-ацетата (витамина Е). В пять мерных пробирок вместимостью по 5 см³ приливают 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 см³ раствора α-токоферола массовой концентрации 20 мкг/см³. В первые четыре пробирки добавляют 3,5; 3,0; 2,0 и 1,0 см³ абсолютированного этилового спирта. Затем в пробирки добавляют по 0,5 см раствора ο-фенантролина и по 0,5 см³ раствора хлорного железа, перемешивают. Ставят опытную пробу в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптические плотности испытуемых растворов в порядке возрастания их концентрации на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны (520 ± 25) нм относительно абсолютированного этилового спирта. Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения α-токоферола. По полученным данным строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значения разности оптической плотности испытуемых растворов и контрольного раствора, на оси абсцисс – содержание α-токоферола, мкг/5 см³(10, 20, 40, 60 и 80 мкг/5 см³).

Приготовление элюирующих растворов

Приготовление раствора I. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 6 см³ диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

Приготовление раствора II. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 12 см³ диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

Приготовление раствора III. В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 30 см³ диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.