МОДУЛЬ I

ОБЩАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

ЗАНЯТИЕ № 1

Дата________________

Тема: ВВЕДЕНИЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ ЛАБОРАТОРИЮ.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

План занятия

1. Знакомство с режимом работы в микробиологической лаборатории и рабочим местом.

2. Знакомство с иммерсионным микроскопом и правилами работы с ним.

3. Обучение микроскопии на готовых препаратах-мазках с применением иммерсионной системы.

4. Правила обращения с культурами микробов.

5. Приготовление препарата-мазка и его фиксация.

6. Основные преимущества и принципы контрастирования микропрепаратов. Знакомство с основными анилиновыми красителями. Окрашивание и микроскопия мазка.

7. Бактериоскопическое исследование препарата «раздавленная капля» и микропрепаратов контрастированных методами негативной окраски по Бурри, позитивной - фуксином.

Методические указания

1. Режим работы в бактериологической лаборатории.

Учебная комната на кафедре микробиологии представляет собой учебную бактериологическую лабораторию вуза, в которой студенты работают с живыми микроорганизмами IV группы патогенности (возбудители бактериальных, грибковых, вирусных септицемий, менингитов, пневмоний, энтеритов, токсикоинфекций и острых отравлений). Доступ к заразному материалу, возможность его изучения, является обязательным элементом обучения студентов стоматологов. Работа в микробиологической лаборатории имеет ряд особенностей, которые необходимо строго соблюдать для поддержания личной и общественной безопасности. Основные правила заключаются в следующем:

1. Студенты в учебную комнату допускаются в рабочей одежде, представляющую собой медицинский халат, шапочку, сменную обувь.

2. До начала занятия в рабочей тетради записывают протокол занятия, в котором по мере проведения исследования делают записи и зарисовки.

3. Личные вещи студента помещаются в специально отведенный шкаф, на рабочем месте допускаются рабочая тетрадь, цветные карандаши, ручка.

4. В помещении лаборатории соблюдают чистоту и порядок, запрещены прием пищи, курение, излишние разговоры и движения, каждый студент имеет свое рабочее место и отвечает за порядок на нем.

5. Материал для работы принимает дежурный по группе у лаборанта кафедры и раздает студентам, по окончанию работы последовательность обратная, студенты сдают материал дежурному, а он в свою очередь лаборанту.

6. Предметы, использованные при работе с живыми микробами, должны быть сразу обеззаражены либо прожиганием на пламени, либо погружением в дезинфицирующий раствор. Все выданные приборы и материалы должны оставаться в предусмотренных носителях и не выкладываться на рабочую поверхность столов. В случае возникновения аварийных ситуаций (например, разбита пробирка с заразным материалом) студент должен немедленно поставить в известность преподавателя и вместе с ним обеззаразить рабочее место.

7. В конце занятия каждый студент обязан привести в порядок свое рабочее место, вымыть руки дезинфицирующим раствором и мылом, представить рабочую тетрадь с зарисовками и протоколом.

Оборудование рабочего места.

На рабочем столе должно быть все необходимое для работы: микроскоп, иммерсионное масло, бактериологическая петля, спиртовка, набор красок, промывалка и ванна для промывки препаратов, предметные стекла и салфетки для протирания их, штатив для пробирок с культурами, пинцет, фильтровальная бумага для высушивания препаратов и банка для отработанных стекол.

2. Знакомство с иммерсионным микроскопом.

Важнейшей характеристикой каждого объектива микроскопа является его разрешающаяся способность. Разрешающей способностью называется минимальное расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно (т.е. не сливаются в одну). Разрешающая способность объектива ограничивается такими недостатками оптической системы, как сферическая и хроматическая аберрации, дифракция и т.д. Если первые два явления устранимы, то явление дифракции имеет место в любой оптической системе. Оно ограничивает разрешающую способность оптических систем. Разрешающая способность объектива с учетом явлений дифракции описывается следующей формулой:

А = 0,61 Х ,

где А - минимальное расстояние между двумя точками объекта (разрешающая способность);

n - показатель преломления среды между препаратом и фронтальной линзой объектива (в случае масляной иммерсии n=1,51);

α- угол между оптической осью объектива и наиболее крайним лучом, попадающим в объектив из центра препарата;

λ- длина световой волны;

0,61 - коэффициент, который учитывает геометрические факторы при вычислении освещенности первого дифракционного максимума от круглого отверстия.

Величина n·sinα постоянна для каждого объектива и называется числовой, или нумерической, апертурой. Она выгравирована на оправе объектива. В монобромнафталиновых иммерсионных объективах нумерическая апертура может варьировать в пределах от 1,25 до 1,60. При наличии воздуха между фронтальной линзой и покровным стеклом нумерическая апертура не превышает 0,95.

Из приведенной выше формулы видно, что разрешающая способность объектива прямо пропорциональная его числовой апертуре и обратно пропорциональна длине волны света, используемого при микроскопии. При микроскопии в видимом свете с длиной волны порядка 0,55 микрона и иммерсионным объективом с максимальной нумерической апертурой 1,60 разрешающая способность равна:

А = 0,61×

Величина угла, при котором глаз способен различать раздельно две точки, называется углом резкого зрения. Для получения на сетчатке раздельного изображения двух точек световые лучи должны попасть в глаз под углом зрения, который стягивает дугу от 2 до 4 минут.

Изображение структур, разрешенных объективом, может быть увеличено окуляром лишь настолько, чтобы оно просматривалось под углом, стягивающим дугу величиной от 2 до 4 минут. Это – полезное увеличение микроскопа. Полезное увеличение микроскопа не может превышать числовую апертуру более чем в 1000 раз. Поэтому максимальное полезное увеличение для микроскопов, имеющих иммерсионные объективы с апертурой 1,4 – 1,6, составляет 1400 – 1600. Применение в таких микроскопах более сильных окуляров никаких дополнительных деталей к структуре препарата, разрешаемой объективом, не выявляет.

Для полного использования разрешающей способности иммерсионного объектива необходимо выполнять следующие основные правила:

1. конденсор осветительного аппарата должен быть поднят до отказа (до уровня предметного столика).

2. диафрагма конденсора должна быть полностью открыта.

3. во всех без исключения случаях работа ведется с плоским зеркалом, так как конденсор рассчитан на работу с параллельными пучками света.

Наряду с увеличением и нумерической апертурой одной из важных характеристик объектива является его свободное рабочее расстояние, т.е. расстояние между верхней поверхностью препарата и нижней поверхностью фронтальной линзы объектива при наведенном на фокус объективе. Эти расстояния следующие:

для объектива с увеличением 8× - 8,5 мм;

для объектива с увеличением 40× - 0,4 мм;

для объектива с увеличением 90× - 0,2 мм.

Знание этих расстояний необходимо для того, чтобы быстро сфокусировать микроскоп на препарате.

Рисунок 1. Схема строения микроскопа МБР-1

Обозначения:

1 - окуляр;

2 - тубус;

3 -штатив (колонка и ножка);

4- макрометрический винт

5- микрометрический винт;

6 - зеркало;

7 - конденсор;

8- предметный столик;

9- объектив;

10 - револьвер.

Порядок работы с микроскопом

1. проверить состояние осветительного аппарата (поднять конденсор, открыть его диафрагму, поставить плоское зеркало, направить его на источник освещения);

2. на поверхность изучаемого микропрепарата нанести каплю иммерсионного масла и положить на столик микроскопа;

3. выбрать иммерсионный объектив с черной полосой увеличение 90×, подвести под тубус до появления характерного щелчка, свидетельствующего о закреплении объектива и смотря сбоку с помощью макровинта опустить его до контакта фронтальной линзы с поверхностью стекла;

4. смотря в окуляр макровинт, медленно вращая на себя, настроить изображение объекта, когда различимы форма и цвет бактерий с помощью микровинта навести ясность микроизображения.

Техника безопасности при работе с микроскопом.

1. микроскоп переносят, держа за колонку;

2. в момент переноса револьвер должен находиться в нейтральном положении, т. е. над предметным столиком не должно быть объективов;

3. опускание объектива с помощью макровинта может производиться только при непосредственном контроле, наблюдении сбоку;

4. микровинтом можно совершать не более ½ оборота, если для наведения ясности этого недостаточно, необходимо вернуться к макровинту;

5. по окончанию работы с помощью макровинта объектив следует поднять над предметным столиком и перевести револьвер в нейтральное положение.