Методика

Если нет других указаний в частной статье, хроматогра-фическое разделение выполняют восходящим способом в насыщенной атмосфере.

Предпочтительнее использовать такие подвижные фазы, которые обеспечивают величины Rf испытуемых соединений в пределах от 0.3 до 0.7.

Если нет других указаний в частной статье, пятна или полосы наносят на расстоянии не менее 15мм от нижнего края и не менее 10мм от боковых краев пластинки.

Слой жидкости в хроматографической камере должен быть таким, чтобы после помещения в него пластинки пятна или полосы находились над уровнем жидкости.

Если условия насыщения хроматографической камеры, нанесения пятен или хроматографирования отличаются от указанных выше, они должны быть описаны в частной статье.

Проверка пригодности хроматографической системы

Результаты анализа методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) считаются достоверными, если выполняются требования испытания "Проверка пригодности хроматографической системы".

Хроматографическая система считается пригодной, если:

на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки пригодности хроматографической системы, четко делятся пятна указанных в частной статье веществ;

Rf основного пятна на хроматограмме испытуемого раствора должно быть около величины, указанной в частной статье;

на хроматограмме раствора сравнения, используемого для проверки чувствительности хроматографической системы, должно быть четко видно пятно.

Способы оценки содержания примесей методом тсх

При контроле примесей нежелательно включение в частную статью требования отсутствия пятна контролируемой примеси на хроматограмме испытуемого раствора.

Методом ТСХ могут контролироваться как конкретно указываемые (специфические) примеси, так и общее содержание примесей.

Контроль специфических примесей

Контроль специфических примесей применяют в тех случаях, когда содержание каких-то конкретных примесей, возникающих в процессе производства препарата или его хранения, должно быть ограничено ввиду их токсичности или по другим соображениям.

При контроле специфических примесей обычно используют сравнение пятен регламентируемых примесей на хроматограммах испытуемого раствора и растворов сравнения. Типичная регламентация содержания примеси выглядит в этом случае следующим образом:

«На хроматограмме испытуемого раствора, кроме основного пятна, допускается наличие дополнительного пятна, расположенного на уровне пятна на хроматограмме раствора сравнения и не превышающего его по величине и интенсивности поглощения или окраски (не более ... %)».

Контроль общего содержания примесей

В тех случаях, когда нет оснований считать какие-то примеси особо токсичными, часто не так важно знать их истинное содержание. Важно знать, что это содержание не превосходит определенного уровня. В таких случаях используют метод внутренней нормализации - в качестве растворов сравнения обычно используют растворы самой испытуемой субстанции различной концентрации, а содержание примесей находят в пересчете на эту субстанцию.

В зависимости от количества различных растворов субстанции, наносимых на хроматограмму в виде растворов сравнения, контроль общего содержания примесей может быть одноуровневым, двухуровневым и трехуровневым.

Типичная регламентация содержания примеси в одноуровневом варианте выглядит следующим образом:

«На хроматограмме испытуемого раствора любое пятно, кроме основного пятна, не должно превышать по величине и интенсивности поглощения или окраски пятно на хроматограмме раствора сравнения (не более ... %)».

Типичная регламентация содержания примеси в двухуровневом варианте выглядит следующим образом:

«На хроматограмме испытуемого раствора любое пятно, кроме основного пятна, не должно превышать по величине и интенсивности поглощения или окраски основное пятно на хроматограмме раствора сравнения 1 (не более ... %), и только одно пятно может быть интенсивнее пятна на хроматограмме раствора сравнения 2 (не более %)».

Типичная регламентация содержания примеси в трехуровневом варианте выглядит следующим образом:

«На хроматограмме испытуемого раствора любое пятно, кроме основного пятна, не должно превышать по величине и интенсивности поглощения или окраски основное пятно на хроматограмме раствора сравнения 1 (не более ... %), и только одно пятно может быть интенсивнее пятна на хроматограмме раствора сравнения 2 (не более %), и не более чем …пятен могут быть интенсивнее основного пятна на хроматограмме раствора сравнения 3».

В двух- и трехуровневом вариантах возможна регламентация и общей суммы примесей.

Хроматографический процесс, протекающий при движении подвижной фазы в тонком слое сорбента (носителя), нанесенном на инертную поверхность называется тонкослойной хроматографией.

Неподвижной фазой в данном случае являются сам твердый сорбент, либо вещества, предварительно на него нанесенные. Механизм хроматографического разделения может быть различным, но чаще всего он является адсорбционным. Перемещение подвижной фазы в слое сорбента, как правило, осуществляется восходящим методом.

Следует отметить, что по скорости разделения, чувствительности и возможности идентификации разделяемых компонентов, метод хроматографии в тонком слое сорбента превосходит все известные способы классической аналитической химии.

По сравнению с хроматографией на бумаге этот метод имеет ряд преимуществ, основными из которых являются: высокая скорость процесса хроматографирования, возможность использования в качестве неподвижных фаз (носителей) разнообразных сорбентов, а также сильнокислых, щелочных или иных взаимодействующих с бумагой подвижных фаз и жестких методов открытия пятен путем обработки хроматограмм агрессивными веществами при повышенных температурах.

Тонкослойная хроматография применяется в двух модификациях: с закрепленным и незакрепленным слоем сорбента.

Хроматография в тонком слое сорбента позволяет пользоваться такими агрессивными реагентами, как концентрированные кислоты, щелочи, сильные окислители и другие.

Константа Rf характерна для каждого вещества в данных условиях (сорбент, растворитель, температура и другие факторы) и зависит от ряда факторов: способа разделения, насыщенности камеры, качества, активности и толщины слоя сорбента, чистоты и длины пробега растворителей, количества нанесенных веществ на стартовую линию, Поэтому для характеристики разделяемых смесей пользуются методом идентификации со стандартными веществами.

Международная фармакопея рекомендует идентифицировать методом тонкослойной хроматографии следующие лекарственные препараты: дигитоксин, гризеофульвин, гидрокортизон, гентамицина сульфат, метилтестостерон, преднизолон, прогестерон, тетрациклина гидрохлорид, тестостерона пропионат и другие, а также определять посторонние примеси в ацетазоламиде, амитриптилина гидрохлориде, бетаметазоне, хлорамфениколе, кофеине, цианокобаломине, дексаметазоне, диазепаме, фуросемиде, галоперидоле. ибупрофене, индометацине, маннитоле, метронидазоле, папаверина гидрохлориде, рифампицине и ряде других лекарственных средств (всего порядка 40 лекарственных препаратов), посторонние алкалоиды в кодеина моногидрате, эргометрине гидромалеате, морфина гидрохлориде, хинина гидрохлориде и других.

Согласно требований Государственной фармакопеи Украины данный метод используют для идентификации лекарственных средств следующих групп: антибиотиков (амоксицилина тригидрат, ампицилина натриевая соль, бензилпеницилина натриевая и калиевая соли, гентамицина сульфат, канамицина сульфат, доксициклина хиклат, стрептомицина сульфат, цефиксим, цефотаксима натриевая соль, цефалксин, цефтриаксона натриевая соль); витаминов (кислота фолиевая, пиридоксина гидрохлорид, рибофлавин); гормонов (гидрокортизона ацетат, тирозин); сердечных гликозидов (дигитоксин, дигоксин, уабаин (строфантин G)); аминокислот (аланин, аргинин, аргинина гидрохлорид, ацетилцистеин, валин, пролин, серин, триптофан, фенилаланина гидрохлорид, кислота глютаминовая, метионин), а также бетамезона дипропионата, бупивокаина, глибенкламида, глицерина тринитрата, эргометрина малеата, ибупрофена, ментола рацемического, миконазола нитрата, омепразола, ранитидина, сульфаметаксазола, глюкозы, фруктозы, кальция глюконата, атенолола, бисакодила, бромгексина гидрохлорида, верапамина гидрохлорида, галоперидола, налоксана гидрохлорида, натрия диклофенака, нитрофурала, оксазепама, пентоксифелина, пиперазина адипената, прометазина гидрохлорида, пропилпарагидроксибензоата, фторурацила,хлорпромазина гидрохлорида (аминозин), циклофосфамида, каптоприла. При этом используют различные системы растворителей, исходя из физико-химических свойств анализируемых лекарственных средств, и определяют их идентичность по величине Rf, проявляя хроматограмму с использованием ультрафиолетового света или специфических реактивов.

В Рязанском медицинском институте разработана методика качественного обнаружения мерказолила в таблетках

(А.А.Цуркан, В.И. Ефременко, 1977), поскольку в фармакопее отсутствуют специфические реакции на мерказолил.

Методика определения заключается в следующем:

на стеклянную пластинку наносят окись алюминия, просеивая ее через двойной слой марли. При помощи стеклянной палочки слой сорбента равномерно распределяют, оставляя боковые края пластинки по 0,5 см свободными от сорбента.

Таблетку мерказолила (0,005 г) растворяют (предварительно измельчив) в 2 мл 96° этилового спирта и фильтруют. В качестве системы растворителей используют смесь этанол-гептан (3:2) в количестве 30мл на одно определение. Раствор мерказолила наносят при помощи капилляра на пластинку с сорбентом на линию старта (1,5 см от края пластинки; до образования пятна диаметром 1см и после полного улетучивания спирта, хроматографируют, помещая пластинку в камеру с 30 мл смеси растворителей под углом 10°, созданном стеклянной палочкой толщиной 1см. Когда фронт растворителя находится на расстоянии 1-2 см от верхнего края пластинки, хроматограмму извлекают из камеры, отмечают линию старта встряхиванием сухого сорбента.

Детекцию (проявление) пятна проводят путем опрыскивания пластинки раствором нитропруссида натрия в щелочной среде (3капли раствора нитропруссида натрия на 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида) с расстояния 0,5 м, чтобы не нарушить слой сорбента. На высушенной хроматограмме появляется пятно голубого цвета Rs - 0,60, Rf - 0,30.

Данное определение возможно и на пластинках "Силуфол 254", Методика определения аналогична.

Идентификация лекарственных смесей путем тонкослойной хроматографии заключается в том, что на пластинку наносится 1-2 капли раствора анализируемой смеси и на расстоянии 1,5см друг от друга — стандартные растворы каждого компонента, входящего в состав данной лекарственной формы.

Например: для анализа спиртового раствора состава:

Ментола 1,25

Новокаина 1,0

Анестезина 0,5

Спирта этилового 70% — 50,0

его наносят капилляром в количестве 0,01 — 0,02 мл на ли­нию старта пластинки с окисью алюминия или "Силуфол" с интервалом 1-1,5 см, затем на линию старта наносят растворы стандартных образцов. После удаления растворителя пластинку помещают в камеру с растворителями: хлороформ-эфир (1:1). Подвижная фаза должна пройти путь 10-15 см хроматограммы, затем хроматограмму вынимают из камеры, отмечают линию финиша и удаляют остатки растворителей (в вытяжном шкафу). Проявляют хроматограмму в парах йода и находят значения Rf и Rs (величина Rf для ментола - 0,55, новокаина - 0,40, анестезина -0,18) и делают заключение о доброкачественности анализируемой лекарственной формы.

На кафедре разработаны методики определения амидопирина; лекарственных форм: антипирина 3,0 , новокаина 2,0;

амидопирина 0,25, бутадиона 0,1, дибазола 0,015.

Методика определения амидопирина:

2-3 капли исследуемых растворов с помощью капилляра наносят на линию старта хроматографической пластины, подсушивают и помещают в хроматографическую камеру с элюентом бензол-изопропанол (9:1). Пластину высушивают, проявляют в парах йода, рассчитывают величины Rf и Rs и делают заключение об идентичности и чистоте лекарственного средства.

Методика определения лекарственных форм:

Спиртовые растворы наносят капилляром на пластину "Силуфол" на линию старта с интервалом 1,0-1,5 см, затем наносят растворы стандартных образцов. После удаления растворителей пластинку помещают в камеру с элюентами: бензол-этанол (9:1), бензол-изопропанол (9:1). После прохождения пути растворителя в 10-15см, хроматограмму вынимают из камеры, отмечают линию финиша, сушат и проявляют в парах йода и находят значения Rf и Rs. Делают заключение о доброкачественности анализируемой лекарственной формы.

Определение примесей с помощью хроматографии сводится к тому, что после хроматографирования раствора анализируемого вещества и проявления, на пластинке не должно обнаруживаться дополнительных пятен. Так, например, опре­деляется отсутствие посторонних алкалоидов в таблетках глауцина (ВФС 42-238-73), посторонних сапонинов в дигитонине (ФС 42-830-73), специфических примесей в 0,2% растворе трифтазина для иньекций (ФС 42-798-73).

Государственная фармакопея Украины использует метод тонкослойной хроматографии для определения степени чистоты антибиотиков (рифамицин, стрептомицина сульфат, канамицина сульфат, цефексим, цефалексин, цефтриаксона натриевая соль, ципрофлоксацин); алкалоидов (атропина сульфат, кодеин, кофеин, папаверина гидрохлорид, этилморфина гидрохлорид); витаминов (кислота никотиновая, никотинамид, пиридоксина гидрохлорид, рибофлавин, тиамина гидробромид, эргокальциферол); гормонов (адреналина тартрат, норадреналин); аминокислот (аланин, аргин, глицин, кислота глютаминовая, метионин, орнитин, пролин, серин), а также аминазина, дигоксина, дигитоксина, диазепама, допмина гидрохлорида, дифенгидрамина гидрохлорида, ацикловира, бисакодила, бромгексина гидрохлорида, кислоты аспарагиновой, клонидина гидрохлорида (клофелина), меркаптопурина, метилпарагидроксибензонал (нипагин), нипазола, нитроглицерина, омепразола, пентоксифилина, пиперазина адипината, прокаина гидрохлорида (новокаина), прокаинамида гидрохлорида, прометазина гидрохлорида, ранитидина, резорцина, сульфаметаксозола, трифторпиразина гидрохлорида, уабаина, фентанила, фторурацида, эконазола нитрата.

На кафедре фармацевтической химии ЗГМУ разработана методика определения посторонних примесей в тиотриазолине.

Методика определения:

На линию старта хроматографической пластинки "Силуфол" последовательно наносят РСО тиотриазолина, раствор тиотриазолина с примесью, раствор содержащий 3-метил-5-тио-1,2,4-триазола. Пластинку сушат на воздухе в течение 5мин., затем помещают в хроматографическую камеру, содержащую смесь растворителей ацетон-вода (50:2) и хроматографируют восходящим способом. Когда смесь растворителей дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 3 мин. и помещают на 5мин. в камеру, содержащую кристаллический йод. На хроматограмме должно обнаруживаться пятно тиотриазолина на старте, а примесь в тиотриазолине и раствор 3-метил-5-тио-1,2,4-триазола должны иметь одинаковые значения Rf .

Приготовление РСО (рабочего стандартного образца) 0,1000г тиотриазолина растворяют в 15 мл этанола.

Приготовление раствора тиотриазолина с примесью 3-метил-5-тио-1,2,4-триазола 0,1000 г тиотриазолина растворяют в 15 мл этанола и прибавляют 0,05 г 3-метил-5-тио-1,2,4-триазола.

Приготовление раствора примеси 3-метил-5-тио-1,2,4-триазола

0,05г 3-метил-5-тио-1,2,4-триазола растворяют в 15мл этанола.

Метод тонкослойной хроматографии в сочетании с другими физико-химическими методами применяется и для количественного анализа фармацевтических препаратов, лекарственных смесей, растительного сырья. Количественное определение после хроматографирования может быть проведено после вымывания (элюации) определяемого вещества или непосред­ственно на хроматограммах.

В первом случае количественное определение вещества в элюате проводят спектрофотометрически или фотометрически.