Горизонтальное элюирование

Объемы растворов анализируемых веществ, указанные в частной статье, наносят небольшими порциями, получая круглые пятна (от 1мм до 2мм в диаметре) или полосы (длиной от 5мм до 10мм и шириной от 1мм до 2мм) на подходящем расстоянии от нижнего края и от боковых краев пластинки. Растворы наносят на линию, параллельную нижнему краю пластинки, с интервалом не менее 5мм между нанесенными пробами. После испарения растворителей из нанесенных проб, в желоб хроматографической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное количество подвижной фазы, помещают пластинку горизонтально в хроматографическую камеру и подсоединяют устройство для подачи подвижной фазы в соответствии с инструкцией производителя. Если указано в частной статье, пластинку элюируют, начиная одновременно с двух концов. Камеру закрывают и проводят хроматографирование при температуре от 20⁰С до 25⁰С. После того, как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна указанным способом.

В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном первому.

Визуальная оценка

Идентификация. Основное пятно на хроматограмме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном на хроматограмме, полученной для раствора стандартного образца (раствора сравнения), сравнивая окраску (цвет флюоресценции), размер и величину удерживания (Rf) обоих пятен.

Величину удерживания (Rf) определяют как отношение расстояния от точки нанесения пятна до верхней кромки пятна после хроматографирования к расстоянию, пройденному фронтом растворителя от точки нанесения.

Проверка разделяющей способности неподвижной фазы для идентификации. Обычно для оценки пригодности достаточно испытания на пригодность неподвижной фазы, описанного в разделе 4.1.1. «Реактивы». В особых случаях дополнительные требования указывают в частных статьях.

Испытание на сопутствующие примеси. Дополнительное пятно (пятна) на хроматограмме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном (пятнами) на хроматограмме, полученной для раствора сравнения. В качестве стандартного образца для приготовления раствора сравнения используют как саму примесь (примеси), так и различные разбавления испытуемого раствора.

Проверка разделяющей способности. Требования для проверки разделяющей способности приводят в соответствующих частных статьях.

Проверка чувствительности. Чувствительность считается удовлетворительной, если пятно или полоса четко обнаруживаются на хроматограмме, полученной с наиболее разбавленным раствором сравнения.

Количественные измерения

Требования к разрешению и разделению приводят в частных статьях.

В том случае, когда вещества, разделяемые методом тонкослойной хроматографии, поглощают или флуоресцируют в ультрафиолетовом или видимом свете, их можно количественно определить непосредственно на пластинке, используя подходящее оборудование. Для этого измеряют отражение или пропускание падающего света, передвигая пластинку или измеряющее устройство. Аналогичным образом, используя подходящее оптическое оборудование, можно измерять флуоресценцию. Вещества, содержащие радионуклиды, могут быть количественно определены тремя способами:

непосредственно на пластинке – передвижением пластинки вдоль подходящего счетчика радиоактивности или счетчика радиоактивности вдоль пластины (см. Радиофармацевтические препараты 125);

разрезанием пластинки на полосы и измерением радиоактивности на каждой полосе, используя подходящий счетчик радиоактивности;

соскребанием неподвижной фазы, растворением ее в подходящем сцинтилляционном коктейле и измерением радиоактивности с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Оборудование. Оборудование для измерений непосредственно на пластинке включает в себя:

устройство для прямого нанесения в определенном месте пластинки необходимого количества вещества;

механическое устройство для передвижения пластинки или измерительного устройства вдоль осей Х или У;

самописец и интегратор или компьютер;

для веществ, поглощающих или флуоресцирующих в ультрафиолетовом или видимом свете: для измерения отражения или пропускания используются фотометр с источником света, оптическое устройство, генерирующее монохроматический свет, и фотоячейку соответствующей чувствительности; в том случае, когда измеряется флуоресценция, требуется дополнительно монохроматический фильтр для выбора соответствующей спектральной области излучаемого света;

для веществ, содержащих радионуклиды: подходящий счетчик радиоактивности; для него необходимо проверить линейный диапазон.

Методика. Готовят способом, указанным в частной статье, раствор анализируемого вещества (испытуемый раствор) и, если необходимо, растворы стандартных образцов анализируемых веществ в том же растворителе (растворы сравнения). Наносят одинаковый объем каждого раствора на пластинку и хроматографируют.

Для веществ, поглощающих или флуоресцирующих в ультрафиолетовом или видимом свете. Готовят и наносят не менее трех растворов сравнения, концентрации которых охватывают ожидаемое значение концентрации в испытуемом растворе (около 80%, 100% и 120% от этой концентрации). Опрыскивают, если необходимо, указанным реактивом и регистрируют отражение, пропускание или флуоресценцию на хроматограммах, полученных для испытуемого раствора и растворов сравнения. По полученным данным рассчитывают количество вещества в испытуемом растворе.

Для веществ, содержащих радионуклиды. Готовят и наносят испытуемый раствор, содержащий около 100% ожидаемого значения концентрации. Измеряют радиоактивность как функцию длины пути и записывают радиоактивность каждого полученного пика в процентах от суммарной радиоактивности.

Если нет других указаний в частной статье, результаты определения считают недействительными, если коэффициент разделения (Rs) между измеряемыми на хроматограмме пиками менее 1,0.

Коэффициент разделения (Rs) вычисляют по формуле:

где:

z_b, z_a - расстояния вдоль базовой линии между точкой нанесения образца и перпендикулярами, опущенными из вершин двух соседних пиков, в миллиметрах;

b_0.5a, b_0.5b - ширина пиков на половине высоты, в миллиметрах.

В случае установления предельного содержания примесей с помощью фотометрического детектора важным параметром для определения предела обнаружения является отношение сигнал/шум (S/N):

, где:

H - высота пика анализируемого компонента на хроматограмме раствора сравнения, измеренная от вершины до базовой линии; базовая линия измеряется при этом в интервале двадцати ширин пика, измеренных на половине его высоты;

h - максимальная амплитуда фонового шума на хроматограмме холостого раствора, наблюдаемая в том же интервале, что и для испытуемого раствора.

Оборудование

Пластинки. Допускается использование пластинок, приготовленных в промышленных условиях, если они отвечают требованиям раздела 4.1.1. «Реактивы», а также выдерживают испытание «Проверка пригодности хроматографической системы», описанное в частной статье.

Хроматографическая камера. В необходимых случаях допускается использование хроматографических камер других типов с описанием их в частных статьях.

Допускаются другие условия активации пластинок, описанные в частных статьях.