Бумага для хроматографирования

Для распределительной хроматографии применяют специальную хроматографическую бумагу, приготовленную из высокосортного хлопка и содержащую 95-99% целлюлозы. Иногда перед хроматографированием бумагу подвергают специальной очистке. Например, при наличии в бумаге примесей кальция, железа, меди их удаляют промыванием растворами натрия эдетата (трилона Б), 8-гидроксихинолина.

При выборе бумаги для хроматографирования имеет значение структура волокон целлюлозы, их набухаемость. Сорта бумаги различаются по плотности и скорости движения в ней веществ. Бумага № 1 и № 2 называется «быстрой»,№3 и №4-«медленной».

Бумага для хроматографирования должна содержать достаточное количество неподвижной фазы. Обычные сорта бумаги гидрофильны. Поэтому при применении воды в качестве неподвижной фазы специального увлажнения не требуется. В случае применения другой неподвижной фазы необходимо предварительно пропитать ею бумагу, часто в качестве неподвижной фазы применяют формамид.

Растворители

Обычно выбирают такой подвижный растворитель, в котором, компоненты, подвергающиеся разделению, имеют небольшую растворимость. Иначе вещества будут перемещаться с фронтом растворителя и разделения не произойдёт. Если же вещества очень мало растворимы в подвижном растворителе они будут оставаться на месте нанесения капли раствора. Растворимость в подвижном растворителе должна быть больше, чем в неподвижном.

Для разделения гидрофильных веществ обычно применяют смеси органических жидкостей с 10-40% воды, содержащие добавки кислот, оснований или солей для подавления или усиления диссоциации веществ с кислотными или основными функциональными группами. Одновременно они повышают гидрофильность системы.

Умеренно гидрофильные вещества разделяются в органи- ческих растворителях (хлороформ, бензол, этилацетат, петро-лейный эфир), насыщенных водой. Из вышесказанного следует, что при разделении гидрофильных и среднегидрофильных веществ неподвижной фазой служит не смешивающийся с водой органический растворитель. Такую двухфазную систему получают встряхиванием воды с органическим растворителем, не смешивающимся с водой. После разделения обеих фаз, та, которая богаче органическим растворителем, служит подвижной фазой.

Растворители для хроматографирования должны быть чис­тыми, без примесей посторонних веществ.

Методика хроматографического разделения

В зависимости от направлений движения подвижной фазы различают три способа хроматографии: нисходящая, восходящая, круговая (радиальная). Кроме того, существуют способы двумерной и повторной хроматографии.

При восходящей хроматографии движение растворителя и разделяемых веществ происходит снизу вверх.

Вырезают полоску хроматографической бумаги с учетом размера хроматографической камеры. На расстоянии 6-7см от нижнего края бумаги проводят простым карандашом линию старта и отмечают места нанесения проб. Расстояние между отдельными пробами должно быть не менее 2см.

Растворы хроматографируемых веществ наносятся на подготовленную бумагу с помощью капилляров или микропипетки.

Диаметр пятен должен быть не более 6-10мм. Наносимое на бумагу количество вещества может колебаться от 0,1до 1000мкг, что указывается в соответствующих методиках. При малой концентрации исследуемого вещества в растворе и необходимости нанесения нескольких капель, каждую последующую каплю раствора наносят после высыхания предыдущей.

На дно хроматографической камеры наливают подвижный растворитель и полоску бумаги с нанесенными образцами погружают нижним краем на 2-3см в подвижный растворитель. Верхний край полоски бумаги закрепляют с помощью стеклянной палочки на выступах камеры и последнюю герметично закрывают.

Вследствие капиллярных сил подвижный растворитель поднимается вверх по бумаге и разделяет компоненты смеси на зоны, которые движутся по бумаге с различными скоростями. Опыт считают законченным, когда фронт растворителя приближается к верхнему краю полоски бумаги. После этого хроматограмму вынимают из камеры, отмечают карандашом положение растворителя (фронт растворителя) и высушивают.

Для получения нисходящей хроматограммы в верхней части хроматографической камеры устанавливают на выступах небольшую ванночку с подвижной или неподвижной фазой достаточной для образования слоя глубиной 2,5см. Полоску хроматографической бумаги с нанесенными образцами погружают в ванночку и укрепляют предметным стеклом, чтобы бумага не соприкасалась с ванночкой. Второй конец полоски свободно свисает в камере, не касаясь её стенок и дна.

Растворитель из ванночки просачивается вследствие действия капиллярных сил и сил тяжести вниз по бумаге и обеспечивает движение зон компонентов разделяемой смеси. Хроматографирование обычно заканчивается при приближении фронта подвижной фазы к нижнему концу полоски бумаги.

Для получения круговой хроматограммы вырезают круг из листа хроматографической бумаги и на расстоянии 1-2см. от центра по кругу наносят исследуемый раствор. В качестве сосуда для хроматографирования удобно использовать эксикатор. Диаметр бумажного круга должен быть на 2-3см больше, чем диаметр нижней узкой части эксикатора.

Бумажный круг укладывают под узкой частью эксикатора. Для подачи подвижного растворителя к центру круга вырезают полоску - «фитиль», который отгибают вниз и опускают в растворитель, налитый на дно эксикатора. Скорость поступления растворителя регулируют изменением ширины фитиля.

Хроматографирование производят в герметически закрытом эксикаторе. После высушивания и проявления вещества располагаются на хроматограмме в виде концентрических зон

Если при помощи одного растворителя не удаётся разделить сложную смесь веществ, то применяют двумерное хроматографирование последовательно в двух системах растворителей.

Для получения двумерной хроматограммы применяют квадратные листы бумаги размером 20x20, 30x30, 40х40см в зависимости от размера камеры.

В левом углу на расстоянии 4-5см от краев помещают каплю анализируемой смеси веществ, высушивают, прошивают ниткой верхнюю часть листа и помещают в сосуд для восходящего хроматографирования, на дно которого налита первая система растворителей. Лист укрепляют в вертикальном положении, фиксируя нитку пластырем к наружным стенкам камеры. После того, как растворитель поднимется на некоторое расстояние (20-25см), хроматографирование прекращают, бумагу высушивают и поворачивают на 90° против часовой стрелки. При этом место нанесения капли исследуемого раствора окажется справа, а линия, по которой происходит подъем зон анализируемых веществ, внизу. В таком положении бумагу помещают в камеру с другим растворителем и снова хроматографируют по восходящему методу.

При повторном хроматографировании процесс разделения осуществляют дважды в одной и той же системе растворителей.

По окончании хроматографирования пятна веществ на хроматограммах открывают при просмотре в видимом или ультрафиолетовом свете. При необходимости хроматограмму предварительно обрабатывают (погружением или опрыскиванием) раствором реактива, дающего цветные реакции с хроматографируемыми веществами.

Для обнаружения пятен вычисляют величину Rf по формуле:

Rf = a/b; где

а - расстояние от линии старта до центра пятна,

b - расстояние от линии старта до фронта подвижной фазы.

Разработана методика определения величины Rf для иден-тификации некоторых сульфаниламидных препаратов, (В.И.Шах, Ф.Е. Каган, 1959) и производных п-аминобензойной кислоты (таблица 1).

Для хроматографирования сульфаниламидных препаратов применяют две системы растворителей: 1) н-бутанол - уксусная кислота - вода (10 : 2 : 5), 2) н-бутанол - 10% раствор аммиака - вода (8:2:6). Готовят приблизительно 0,4% раствор препарата в органической фазе системы растворителей, одну каплю раствора наносят на бумагу марки «медленная» и хроматографируют восходящим методом 10-20 часов. Для проявления хроматограмму опрыскивают смесью равных количеств 5% раствора натрия нитрита и разведенной кислоты хлористоводородной, высушивают, после чего обрабатывают щелочным раствором β-нафтола. Сульфаниламидные препараты обнаруживаются в форме красно-оранжевых пятен. В таблице 1 даны полученные значения.

Таблица 1

Величины Rf некоторых сульфаниламидных препаратов

Препараты	Величины Rf
	система 1	система 2
Стрептоцид Сульгин Сульфадимезин Сульфадиметоксин Сульфапиридазин Сульфатиазин Сульфацил Уросульфан Фтазин Фталазол Этазол	0,63 0,53 0,90 0,91 0,86 0,75 - 0,76 0,84 — 0,85 0,68 0,88 0,89 0,91	0,53 — 0,54 0,33 0,50 0,38 0,36 0,34 0,11 0,04 0,13 0,14 — 0,15 0,35 — 0,36

Определение величины Rf для идентификации производных п-аминобензойной кислоты определены также в двух системах растворителей:

1) н-бутанол — ледяная уксусная кислота (10:2) — вода (до насыщения),

2) н-бутанол — концентрированная кислота хлористо-водородная — вода (50 : 7,5 : 13,5) (Л.А, Кириченко, 1962),

Таблица 2

Величины Rf производных п-аминобензойной кислоты

Препараты	Величины Rf
	система 1	система 2
Анестезин Дикаин	0,95 0,85	0,93 0,61
Новокаин	0,68 — 0,69	0,23
Новокаинамид	0,64	0,21

Идентификация лекарственных средств в лекарственных формах проводят по величине Rf с помощью свидетеля.

Разработаны условия количественного определения некоторых лекарственных веществ после хроматографирования на бумаге: атропина в настойке красавки (система: н-бутанол — уксусная кислота — вода; 10: 2; до насыщения, метод определения — денситометрический), дигитоксина и гитоксина в растительном сырье наперстянки (система: хлороформ — формамид) до насыщения; элюирующий растворитель — этанол, метод определения - фотоэлектроколориметрический), эризимозид в растительном сырье желтушника (система: толуол - н-бутанол — вода, 1 ; 1 : до насыщения: элюирующий растворитель этанол, метод определения — фотоэлектроколоритметрия.

Государственная фармакопея Украины для идентификации, определения чистоты, а также количественного содержания лекарственных средств и лекарственных препаратов приводит общие статьи: "Тонкослойная хроматография", "Газовая, жидкостная хроматографии".