Теория хроматографического разделения

Известно несколько теорий хроматографического разделения. Наиболее популярны теория теоретических тарелок и кинети-ческая теория.

Теория теоретических тарелок основана на некоторых допущениях:

колонка состоит из определённого числа теоретических тарелок;

равновесие на каждой тарелке устанавливается мгновенно;

на любой тарелке в любой момент времени число молекул (ионов) сорбируемых компонентов пробы значительно меньше, чем число сорбируемых молекул (ионов) элюента (подвижная фаза, вводимая в слой неподвижной фазы), т.е. вводимая проба должна быть малой;

все протекающие на колонке процессы рассматриваются как взаимно независимые.

Теоретическая тарелка – это гипотетическая зона, высота которой соответствует достижению равновесия между двумя фазами. Чем больше теоретических тарелок в колонке, тем эффективнее колонка. Эффективность колонки – это характеристика качества колонки, определяемая числом теоретических тарелок и высотой теоретической тарелки.

Согласно этой теории хроматографическая колонка мысленно делится на ряд элементарных участков-«тарелок», и на каждой тарелке очень быстро устанавливается равновесия между сорбентом и подвижной фазой (ПФ). Каждая новая фаза (ПФ) вызывает смещение этого равновесия, вследствие чего часть вещества переносится на следующую тарелку. В результате этого хроматографируемое вещество распределяется на нескольких тарелках, причём на средних тарелках его концентрация оказывается максимальной по сравнению с соседними тарелками.

Рис.1. Схема хроматограммы ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)

На рис.1 схематически изображена хроматограмма в случае разделения трехкомпонентной смеси, состоящей из компонента 1 и 2, сорбируемых в колонке, и компонента 3, не сорбируемого в колонке. Каждому из трёх компонентов на хроматограмме отвечает свой пик. По оси абсцисс откладывается время, по оси ординат – аналитический сигнал, зависящий от концентрации веществ в элюате. Время от момента ввода пробы до регистрации максимума пика называют временем удержания (элюирования) t_R.

Время удерживания – качественная характеристика каждого вещества.

t_R⁰ – время выхода несорбируемого компонента (3) (расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика неудерживаемого компонента, мм);

tR` ( ) – время удерживания вещества 1 (расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, мм);

tR``( ) – время удерживания вещества 2 (расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, мм);

b – ширина пиков (1, 2), мм;

b_0,5a; b_0,5b – ширина пиков на половине их высоты, мм

b_0,05 – ширина пика на 1/20 его высоты, мм;

h – высота пика соответствующего компонента;

A – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 его высоты;

L – длина хроматографической колонки;

КВНФ, КВПФ – количество растворённого вещества в неподвижной фазе (НФ) и подвижной фазе (ПФ);

K – равновесный коэффициент, равный отношению концентрации определяемого вещества в неподвижной и подвижной фазе;

Vs, Vm – объём неподвижной и подвижной фазы соответственно;

h_n – абсолютное значение наибольшей флуктуации шума от базовой линии на хроматограмме контрольного раствора, которое наблюдается на промежутке, равному двадцатикратной ширине на половине высоты пика, помещенному равномерно около места размещения пика;

S – площадь пика.

Хроматографический процесс характеризуется следующими критериями: удерживание, эффективность и степень разделения. Их определяют по хроматограмме.

Для идентификации веществ пользуются относительным объёмом удерживания (r). Для вещества 1 относительный объём удерживания рассчитывают по формуле:

, где

t_cm – время удерживания стандартного вещества.

Для проверки достоверности результатов анализа используют такие показатели, как коэффициент симметрии пика, коэффициент разделения, число теоретических тарелок, коэффициент ёмкости компонента и отношение сигнал/шум.

Форма пика зависит от нагрузки и условий хроматографирования. При правильном выборе условий хроматографирования образуются симметричные пики. Иногда образуются пики с «хвостом» или пики с крутым задним фронтом. Для проверки правильности выбора условий хроматографирования определяют коэффициент симметрии пика (Ks) (рис.1):

Разделение смеси на отдельные пики по мере их продвижения колонкой характеризуется коэффициентом разделения (Rs):

Если Rs < 1, то разделение двух веществ неполное. При Rs > 1 наблюдается полное разделение двух компонентов смеси.

Эффективность колонки количественно выражается числом теоретических тарелок (n):

Чем эффективнее колонка, тем образуются более узкие пики.

Как характеристику эффективности колонки используют также высоту (Н), эквивалентную теоретической тарелке (ВЭТТ), которую рассчитывают по формуле:

Коэффициент ёмкости k' или коэффициент распределения Д_m определяют как:

Если коэффициент ёмкости k^' мал, то вещество слабо удерживается и продвигается по колонке практически с той же скоростью, что и подвижная фаза (ПФ). Если же коэффициент ёмкости слишком велик, то время пребывания вещества в колонке будет большим и на анализ потребуется много времени.

Во время записи хроматографического процесса даже в холостом опыте самописец фиксирует не прямую, а волнистую линию. Это так называемый «шум». Погранично допустимый уровень шумов регламентируют отношением сигнал/шум (S/N), которое определяют по формуле:

Количественный анализ методом ВЭЖХ основывается на предположении, что площади (или высоты) пиков, которые отвечают индивидуальным веществам на хроматограмме, пропорциональны их количеству или концентрации Площадь пиков S на хроматограмме измеряют при помощи планиметра, интеграторов площади пиков, взвешиванием вырезанных пиков или вычисляют по следующим формулам:

Количественное содержание вещества можно также определять и другими методами: метод абсолютного градуирования, внутреннего стандарта, метод нормирования.