7.2.5. Биологический метод исследования грызунов

В качестве биопробных животных могут быть использованы белые мыши и морские свинки.

Способ приготовления суспензий для биопроб описан выше. Заражают биопробных животных подкожно в паховую область; белым мышам вводят по 0,2 мл суспензии, морским свинкам - по 0,5 - 1,0 мл. При исследовании сильно загрязненного материала (загнившие трупы, субстраты нор, помет) заражают биопробных животных накожно.

Павших биопробных животных исследуют, проводя вскрытие по полной схеме (отсепаровка кожи, осмотр и посев лимфоузлов, посев всех органов, крови, серологическое исследование на наличие антигена). От павшей биопробы обязательно ставят пассажи до выяснения причины гибели. После обеззараживания суспензия органов павшей биопробы может быть исследована в ПЦР.

Биопробных животных, выживших после заражения, забивают через 6 суток также с полным бактериологическим исследованием без пассажа. При исследовании материала из сочетанных природных очагов чумы и туляремии биопробных животных забивают на 8 - 9-е сутки.

7.2.6. Идентификация выделенных культур

чумного микроба

Первичная (предварительная) идентификация выделенной культуры проводится сразу после ее выделения по следующим признакам:

- морфология роста на питательном агаре и бульоне;

- морфология клетки, характер окраски по Граму;

- лизис диагностическими бактериофагами Л-413, Покровской;

- ферментация мочевины, рамнозы, глицерина (при отсутствии ЦДС);

- характерный рост на среде ЦДС (отсутствие способности к ферментации мочевины и лактозы);

- чувствительность к антибиотикам методом дисков (при выделении первой культуры).

Окончательная идентификация и изучение культуры чумы проводится в стационарной лаборатории противочумной станции или института, имеющих разрешение на проведение экспериментальной работы с микробами I группы патогенности по следующим признакам:

- наличие FI;

- биохимическая активность (пестрый ряд), подвижность;

- вирулентность для лабораторных животных;

- плазмидный состав (pCad, pPst, pFra);

- способность к нитрификации и денитрификации;

- пестицин - фибринолизин - плазмокоагулазная активность;

- чувствительность к пестицину 1;

- питательная потребность при необходимости.

7.2.7. Серологический метод исследования

полевого материала

Серологические реакции направлены на поиск антител к специфическому антигену FI в сыворотке крови у носителей чумы, наземных хищников, домашних животных и антигена в тканях и органах зверьков с патологоанатомическими изменениями, их трупов, в субстратах нор теплокровных, остатках пищи и погадках хищных птиц, субстратах гнезд, в помете носителей, почве.

При выполнении серологических исследований должны быть соблюдены следующие правила:

- серологические реакции должны ставиться только с обеззараженным материалом;

- все иммунобиологические и диагностические препараты должны иметь номера госрегистрации и лицензии на изготовление;

- планшеты, пипетки, капельницы, шприцы должны быть вымыты моющим средством, хорошо отмыты обильным количеством воды, последнее ополаскивание проводят дистиллированной водой; луночки планшетов должны быть гладкими и прозрачными;

- сыворотки человека и животных (верблюда, кошек, собак), а также мутные сыворотки и с признаками гемолиза необходимо перед исследованием адсорбировать 50%-ной взвесью формалинизированных, но не сенсибилизированных эритроцитов;

- все ингредиенты для серологических реакций должны быть оттитрованы (не реже 1 раза в 2 недели), формалин перед обследовательским сезоном адсорбирован мелом (1:1) для инактивации кислых продуктов в коммерческом препарате и проверен на антибактериальную активность;

- все исследования проводят согласно действующим инструктивно - методическим материалам по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы.

Для поиска антител исследуют сыворотки, смывы из сердца и крупных сосудов или высушенные на фильтровальных бумажках образцы крови и сыворотки животных. Поиск антител осуществляют у зверьков, относительно резистентных к чумному микробу (малый, длиннохвостый, горный, даурский суслики, полуденная песчанка с левого берега Волги, даурская пищуха, мелкие куньи и др.). Для обнаружения антител используют реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с антигенным диагностикумом, а также реакцию нейтрализации антигена с иммуноглобулиновым диагностикумом. При массовых исследованиях реакции ставят в два этапа: вначале каждая из реакций в двух луночках и только при положительных результатах ставят развернутые реакции для определения их титра. Система однонаправленных реакций весьма информативна, т.к. по соотношению титров двух реакций (превышение титра РНАг) можно судить о давности контакта зверька с микробом, а при достаточно большом количестве исследований - о фазе эпизоотии в данном участке территории. С этой же целью ставят пробу с восстановителем 2-меркаптэтанолом (CH2OHCH23H), которая дифференцирует макро- и микроглобулины.

При сомнительных результатах реакции повторяют после адсорбции исследуемого материала 50%-ной взвесью формалинизированных и несенсибилизированных эритроцитов, параллельно ставят идентичные реакции с гетерологичными диагностикумами (туляремийный, бруцеллезный, холерный и др.).

Для поиска антигена готовят суспензии из исследуемого материала, добавляя к нему 0,9%-ный раствор хлористого натрия с 2%-ным раствором формалина. На 1 часть субстрата добавляют 10 частей раствора. После отстаивания в течение не менее 3 ч (лучше 20 - 24 ч) отбирают надосадочную жидкость и ставят серологические реакции: РНГА и РТНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом и реакцию нейтрализации антител (РНАт) с антигенным диагностикумом.

С целью подтверждения специфичности результатов следует тот же материал использовать в системе серологических реакций (РНГА-РНАт) с гетерологичными диагностикумами (туляремийный, бруцеллезный, холерный и др.).

Тактика применения иммуноферментного анализа для поиска антигена FI и антител к нему такая же, как при использовании иммуносуспензионных методов.

Полимеразная цепная реакция используется при углубленном эпизоотологическом обследовании территории (преимущественно в пунктах долговременного наблюдения). Исследованию подлежат суспензии органов носителей чумы с характерными патологоанатомическими изменениями, трупов павших зверьков, трупов верблюдов, а также при необходимости суспензии эктопаразитов, субстраты гнезд грызунов, погадки и остатки пищи хищных птиц, пробы почвы и др. Предварительно исследуемые суспензии обеззараживают добавлением мертиолята натрия до конечной концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при 56 °C в течение 30 мин. Для проведения генодиагностического анализа применяют "Тест - систему для выявления Y. pestis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)", производство РосНИПЧИ "Микроб" (рекомендована комитетом МИБП МЗ РФ для практического использования). Для постановки пультиплексной ПЦР использованы праймеры, обеспечивающие специфичную амплификацию фрагментов ДНК двух генов - cafl и pla, локализованных на собственных плазмидах чумного микроба pFra и pPst, соответственно.

Метод ДНК - зондов может быть использован как для характеристики плазмидного профиля штаммов при идентификации выделенных культур, так и при исследовании биологического материала (содержимое бубонов, мокроты, органов животных и т.д.)

Для повышения чувствительности метода возможно подращивание образцов путем помещения нейлонового фильтра с нанесенным материалом на поверхность агара Хоттингера на 16 - 24 ч при 28 °C. После нанесения исследуемого материала на фильтр его инактивируют парами хлороформа. Для этого на крышку чашки Петри, в которую помещен фильтр с исследуемым материалом, наносят 0,5 мл хлороформа, выдерживают в таком виде (крышка снизу) в эксикаторе в течение 30 мин, после чего фильтр считается обеззараженным и может пересылаться для дальнейшего исследования в стационарную лабораторию противочумной станции или института.