Оценка результатов исследования.

СМЖ является стерильной средой, поэтому выделение любого микроорганизма должно расцениваться как положительный результат. Редко нахождение условно-патогенных микроорганизмов и сапрофитов, которые ранее никогда не выявлялись, может вызвать сомнение и расцениваться как загрязнение или в момент взятия пробы, или при повторных высевах со среды обогащения. В таких случаях большое значение имеют клинические данные.

При вторичных менингитах, обусловленных инфекцией гнойно-воспалительных процессов различной локализации необходимо провести микробиологическое исследование этого очага, потому что возможна вероятность обнаружения идентичных микроорганизмов и в СМЖ.

У детей параллельно с исследованием СМЖ необходимо проводить исследование гемокультур, так как менингиты часто связаны с бактериемией, и она предшествует появлению микроорганизмов в СМЖ. При хронических процессах с временным улучшением желательно провести микробиологическое исследование ликвора после окончания антибактериального лечения.

Диагностика менингококковой инфекции.

Она основана на бактериологическом исследовании патологического материала, выделении чистой культуры и биохимической идентификации возбудителя. Материалом для исследования могут быть спинномозговая жидкость, кровь, отделяемое носоглотки. Следует помнить, что в мазках СМЖ очень трудно обнаружить микроб, так как менингококки склонны к аутолизу. Для бактериоскопического исследования мазки готовят из СМЖ, из крови при менингококкцемии, из соскобов сыпи при генерализованной форме. Мазки окрашивают метиленовым синим и по Граму. В окрашенных мазках обнаруживают грамотрицательные диплококки или одиночные кокки.

Для выделения возбудителя материал высевают на твердые или полужидкие питательные среды, содержащие сыворотку, кровь или асцитическую жидкость. Посевы инкубируют при 37ºC в присутствии СО2 от 3 до 10%. Время инкубации – 24час. Через 24 часа рассматривают колонии и отбирают оксидазаположительные, что является ориентировочным указанием на принадлежность к роду нейссерий. Идентификацию чистой культуры проводят по ферментации только глюкозы и мальтозы до кислоты и агглютинации группоспецифическими сыворотками.

При выявлении случая острого гнойного менингита менингококковой этиологии окружавшие больного лица обследуются на носительство менингококка в носоглотке. Это, прежде всего лица с явлениями назофарингита и здоровые, тесно контактировавшие с заболевшим. На бактерионосительство обследуется и сам больной перед выпиской из больницы. Материалом служит носоглоточная слизь. Ее берут осторожно изогнутым тампоном с задней стенки глотки, используя шпатель для языка. Мазок следует за 2 часа до еды. Материал здесь же засевают на подогретые и подсушенные чашки Петри со средой, содержащей сыворотку. Оптимальным методом является одновременное использование двух вариантов сывороточного агара: вначале материал растирают на ½ или ¼ чашки со средой, содержащей 5мкг/мл линкомицина для подавления грамположительной флоры, затем тем же тампоном материал засевают на сектор другой чашки с той же средой, но без антибиотика. Если возможности ограничены, то используют только среду с антибиотиками. Чашки доставляют в лабораторию в утепленном состоянии и немедленно помещают в термостат при 37ºС.После 22-24час инкубации посевов носоглоточной слизи их просматривают и отбирают колонии, подозрительные на менингококк – бесцветные, слегка голубоватые в проходящем свете, почти прозрачные, с ровными краями, плоские, влажные, диаметром ≈1-2мм. Их отсевают на 20% сывороточный агар и инкубируют в термостате в присутствии СО2.

На агаре с первичным посевом слизи носоглотки всегда имеется рост представителей рода нейссерий – нормальных обитателей носоглотки человека. Морфологически все нейссерии очень похожи, и представляют собой грамотрицательные кокки с тенденцией образования пар или тетрад. В этом случае важнейшее значение имеет признак пигментообразования. Менингококк никогда не образует пигмента, а многие виды непатогенных нейссерий его образуют. Желтый, кремовый или желто-зеленый пигмент непатогенные нейссерии могут образовывать если не в 1 сутки, то на 2 сутки инкубации. Для более четкого выявления пигментообразования можно использовать сывороточный агар с 10% куриного желтка на физиологическом растворе. Пигментообразование на такой среде четко выявляется уже через 24час.

Чистые культуры, полученные из отсеянных колоний, подозрительных на менингококковые, идентифицируют по морфологическим (в мазках по Граму/Калине), культуральным, ферментативным свойствам. Из культуральных признаков, имеющих главенствующее значение в плане дифференциации с не образующими пигмент грамотрицательными кокками, необходимо учитывать:

• неспособность менингококка расти на средах без добавления сыворотки;

• неспособность менингококка расти в присутствии 0,2% желчи;

• неспособность менингококка расти при 22 С.

Сахаролитические свойства. Для определения сахаролитических свойств лучше всего использовать среды Хью-Лейфзона с уменьшенным содержанием пептона и строгим сбалансированием среды. Менингококк разлагает только глюкозу и мальтозу до кислоты.

Свежие изоляты менингококка подлежат серологическому группированию, однако, большинство ''носоглоточных'' штаммов не имеют капсул и поэтому не агглютинируются.

Из носоглоточной слизи, мокроты здоровых, а иногда и при ОГМ из ликвора выделяется близкая к нейссериям моракселла, подрод бранхамела—Moraxella catarrhalis. Морфологически это также грамотрицательные кокки. На агаре растет в виде круглых, выпуклых, беловатых колоний диаметром 1,5-2мм. Ее отличает от менингококка уже то, что она растет на МПА без сыворотки, ее рост не зависит от присутствия СО2, Она биохимически полностью неактивна.

В редчайших случаях из носоглотки выделяется Neisseriae gonorrhoeae. Колонии гонококка очень сходны с колониями менингококка, их отличают только биохимические свойства – они не гидролизуют мальтозу.

Бактериологическое исследование крови при ОГМ.

Развитию ОГМ всегда предшествует бактериемия. Нередко она носит кратковременный характер, но иногда переходит в септицемию. При менингококковом сепсисе возбудитель можно выделить не только из крови, но и из некротических кожных поражений – элементов сыпи. При массивной менингококкцемии бактериальные клетки можно выявить микроскопически в препарате толстой капли крови, окрашенной метиленовым синим. По некоторым данным литературы, таким же методом можно выявить пневмококк и гемофилы при тяжелых генерализованных формах инфекции.

Наиболее надежным является метод гемокультуры. 5-10мл стерильно взятой крови из вены засевают во флаконы с 50-100мл полужидкого агара. Посевы инкубируют в термостате в течение недели, периодически делая из него высевы. Первый высев через 24 часа производят на 3 чашки с различными средами: МПА, 20%-сывороточный агар, ША. Выросшие на пластинчатых средах колонии далее идентифицируют по уже известной схеме.

Серологическая диагностика менингококкового менингита проводится с использованием РНГА, ИФА. В качестве антигенного диагностикума используют капсульные антигены менингококка. Антитела к ним появляются к 5-7 дню болезни и сохраняются в повышенных титрах в течение 2-3 недель. Для ОГМ другой этиологии такие реакции не используются.

Ход микробиологического исследования при выделении и идентификации гемофилов .

Первый день. Бактериоскопический метод: мазки из исследуемого материала или культуры, окрашенные по Граму, просматривают под микроскопом с иммерсией. Обнаружение в мазках мелких палочек, равномерно окрашенных в бледно-красный цвет, позволяет заподозрить в исследуемом материале наличие гемофилов.

Культуральный метод: исследуемый материал засевают на чашку с кровяным агаром или шоколадным агаром. Кровь от больного засевают на жидкие питательные среды, термостатируют при 37˚С в атмосфере 5-10% СО2.

Второй день. На агаре с нативной кровью гемофилы растут в виде очень мелких (Ǿ-0,5мм), полупрозрачных колоний без особых признаков. На ША гемофилы образуют полупрозрачные, сероватые, нежные, сочные колонии Ǿ 1-2мм. Колонии могут быть:

М-форма—крупные, круглые, слизистые;

S-форма—круглые, полупрозрачные, голубоватые Ǿ около 1мм

R-форма—очень мелкие, менее1мм в диаметре, непрозрачные колонии.

В мазках из М- и S-колоний, окрашенных по Граму, видны мелкие, грамотрицательные палочки. Для R-форм характерны полиморфные иногда нитевидные формы. При окраске тушью по Гинсу у М-иS-форм вокруг клеток видна капсула, хорошо выраженная у М- и небольшая у S-форм. При росте на ША культура палочки инфлюэнцы обладает ''мышиным'' запахом, что является характерным признаком именно этого микроба.

Подозрительные колонии отсевают на косяки с ША. Одновременно проводят высев подозрительных колоний на МПА без крови и дрожжевых добавок. Посевы помещают в термостат на 18-24час. Отсутствие роста культуры на питательном агаре без крови, обнаружение в мазках из колоний, выросших на ША, мелких грамотрицательных палочек с капсулой или без нее, является первым этапом подтверждения выделения одного из видов гемофилов.

Третий день. Из культур, выросших на ША, готовят мазки и окрашивают их по Граму и Гинсу. Культуру идентифицируют до вида по тестам:

• H.influenzae необходимы факторы роста Х и V;

• она каталазаположительна и оксидазаотрицательна;

• уреаза +;

• β-галактозидаза +;

• индол + (у капсульных вариантов);

• редукция нитратов +;

• гемолиз --;

• ферментация глюкозы +;

• ферментация лактозы --.

Результаты по дополнительным биохимическим тестам регистрируют на четвертый день, что позволяет дать ответ о выделении того или иного вида гемофилов.

Ход микробиологического исследования при выделении и идентификации пневмококков.

Первичный посев материала производят только на кровяной агар. В качестве основы питательной среды используют сердечно-мозговой агар либо эритрит-агар, к которым добавляют 5-7% крови, 15-20% лошадиной сыворотки и 1-2% дрожжевого экстракта. Кровь засевают в сердечно-мозговой бульон. Материал из респираторного тракта предварительно гомогенизируют химическим способом, смешивая его с муколитиком N-ацетил-L-цистеином, либо механическим способом с помощью миксера. В итоге получают гомогенат в рабочем разведении 1:10, посев которого производят количественным методом. Чашки инкубируют при температуре 37°С в атмосфере с 5-10%. СО, в течение 18-24 ч.

После инкубации чашки просматривают с использованием лупы, выявляют характерные для пневмококка колонии с а-гемолизом и производят их пересев частыми штрихами на сектора чашки с кровяным агаром для выделения и накопления чистой культуры. При необходимости из колоний готовят окрашенные по Граму мазки и микроскопируют.

Дальнейшее изучение выделенных чистых культур предусматривает установление видовой принадлежности, определение сероварианта и чувствительности к антибиотикам. Иногда определяют вирулентность пневмококка в опыте на белых мышах.

Идентификацию пневмококка осуществляют по совокупности морфологических, физиологических, культуральных, серологических и биохимических свойств. Для дифференциации пневмококка от других видов зеленящих стрептококков используют два основных теста - лизис желчью или дезоксихолатами и чувствительность к оптохину (этилгидрокупреина гидрохлориду).

Тест лизиса желчью. Основан на способности 10% р-ра желчи крупного рогатого скота и 2% р-ра дезоксихолата или таурохолата натрия лизировать молодую культуру пневмококка. Желчь понижает поверхностное натяжение между бактериальной мембраной и средой, что ведет к ускорению естественного аутолитического процесса. Постановку теста осуществляют либо в жидкой среде, когда в две пробирки, одна из которых опытная, содержащая 10% желчный бульон, другая - контрольная с сывороточным бульоном, вносится испытуемая бульонная культура и выдерживается до часа, либо на плотной среде путем нанесения на газонный рост или изолированные колонии капли желчного бульона (дезоксихолата) и выдерживания, пока не высохнет капля (5-10 мин).

При лизисе пневмококка на жидкой среде отмечается просветление в опытной пробирке; на плотной среде на месте капли рост уплотняется или исчезает совсем. Рост стрептококков остается интактным.

Оптохиновый тест. Тест основан на различной чувствительности пневмококка и зеленящих стрептококков к оптохину. Рост пневмококка ингибируется концентрациями оптохина не более 5 мкг/мл. При применении бумажных дисков, импрегнированных оптохином, которые накладывают на инокулированные штрихом чашки с кровяным агаром, зона ингибирования роста S.pneumoniae после 18-часовой инкубации, значительно превышает зону ингибирования роста стрептококков.

Серотипирование пневмококков. Антигенную структуру пневмокков изучают в реакции агглютинации на стекле или в реакции Найфельда с использованием набора сывороток к капсульным полисахаридам. Набор состоит из ”omni”-сыворотки (антитела ко всем 84 сероварам), поливалентных пуловых сывороток, содержащих антитела к 4-7 сероварам и серогруппам, имеющим буквенное обозначение (от "А» до ''I"), и типовых сывороток, входящих в пулы. Идентификация может быть также осуществлена с использованием коммерческих реагентов для реакции коагглютинации

Пневмококк и другие стрептококки группы.В, зеленящие и энтерококки идентифицируют по характеру гемолиза на 5%КА, по их отношению к желчи, нагреванию до 45˚С, повышенному содержанию NaCl (6,5%).

Streptococcus pneumoniae

• дает ά-гемолиз на КА,

• лизируется желчью,

• не растет на простом агаре,

• не растет в присутствии 6,5%NaCl,

• не растет в присутствии 0,25% оптохина,

• не растет при 45˚С.

Для него характерны отрицательный САМР-тест и отрицательный тест на гидролиз гиппурата Na.

Streptococcus agalactiae (гр.В)

• растет на простом МПА,

• растет на бульоне с 6,5% NaCl хотя и слабо,

• растет в присутствии оптохина и желчи,

• не растет при 45˚С.

S.agalactiae дает положительный САМР-тест, гидролизует гиппурат Na, дает β-гемолиз.

Зеленящие и энтерококки

• дают α-гемолиз,

• растут при 45˚С,

• растут в присутствии оптохина,

• растут в присутствии желчи,

• растут в присутствии NaCl 6,5%.

От S.agalactiae их отличает тип гемолиза, отрицательная проба на гидролиз гиппурата Na и отрицательный САМР-тест.

11