3. Количественный анализ в уф и ви спектроскопии.

Количественный анализ в спектрофотометрической практике основан на использовании закона Ламберта-Бера:

г де I₀ – интенсивность падающего света (квант с^-1);

I – интенсивность света, прошедшего через раствор или пленку образца; D – поглощение раствора (безразмерная величина) или оптическая плотность или экстинкция,  - коэффициент молярной экстинкции, отнесенной к единице толщины поглощающего слоя (1 см) и единице концентрации исследуемого раствора С=1 моль/л; l-толщина поглощающего слоя.

И з уравнения :

Коэффициент экстинкции  является постоянной величиной для данного соединения при данной длине волны. При больших значениях  удобно пользоваться его логарифмом lg .

Между поглощением (D) и пропусканием (Т) существует следующая зависимость:

С овременные двухлучевые спектрометры позволяют непосредственно записывать поглощение или пропускание. Спектры поглощения строятся так, что на ординате откладывается поглощение (D) (или lg ) или пропускание (T), а на оси абсцисс – длина волны .

В спектрофотометрии также используются такие показатели, как:

Е сли известны коэффициенты молярной экстинкции (), толщина кюветы (l), и поглощение (D), то концентрацию хромофорного вещества можно найти количественно, используя закон Ламберта-Бера.

В некоторых случаях, если концентрация велика,  становится функцией С и тогда можно сказать, что закон Бера нарушается. Это может быть результатом рассеяния света или структурных изменений (например, димеризации, агрегации или химических изменений) при высоких концентрациях (рис. 2)

Рис 2. Положительное и отрицательное отклонение от закона Бера и причины откло­нений. а - спектральный сдвиг, связанный с возрастанием концентрации, часто в результате полимеризации. Отметим, что при длине волны 2 не наблюдается изменения молярного коэффициента погашения при изменении концентрации. Эта длина волны соответствует изобестической точке; б - кривая, показывающая отклонения от закона Бэра. При 1 отклонение положительное (1). при 3- отрицательное (2). В изобестической точке при 2 закон всегда соблюдается (3).

4. Аппаратура для измерения поглощения в видимом и ультрафиолетовом свете

Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофото­метра. (При описании биохимических образцов почти всегда имеются в виду растворы этих образцов). Несмотря на различия в конструкции, все спектрофотометры состоят из источника света, монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света и измерительного прибора или самописца для регистрации вы­ходного сигнала детектора (рис 3.). Ход работы обычно следующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через растворитель (который может быть буфером), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе Далее фик­сируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества. На практике при­бор настраивают таким образом, чтобы он показывал нулевое поглощение при измерении одного растворителя (это называется настройкой прибора на нуль). Осуществив такую настройку, можно снимать показания, соответствующие непосредственно по­глощению образца.

Рис 3. Схематическое устройство спектрофотометра. Свет от лампы 1 проходит через монохроматор 2 для выделения пучка света с определённой длиной волны. Образец 3 и растворитель 4 содержатся в двух кюветах, помещённых в держатель кювет 5. Свет проходит через кювету и падает на фотоэлемент 6, выходной сигнал которого регистрируется измерительным прибором 7. Держатель кюветы находится на направляющих 8, так что каждая кювета может быть независимо помещена в пучок лучей.

Для получения спектра эта операция повто­ряется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называе­мые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектро­фотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся и различных кюветах) и фиксировать с по­мощью электронного оборудования суммированный поток излу­чении. При этом на самописце вычерчивается спектр.