3. Опис виконання практики згідно з календарним планом

25.06-27.06 — створення календарного графіку роботи, проведення підготовки лабораторного посуду. Приготування поживних середовищ та буферів, необхідних для подальшої експериментальної роботи, нарощування штамів Hansenula polymorpha ger1 та H. polymorpha leu1-1, ознайомлення із методикою виділення плазмідної ДНК Escherichia coli;

01.07-2.07 — електрофорез плазмід pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC в агарозному гелі та рестрикційний аналіз плазмід, приготування компетентних клітин для електротрансформіції;

3.07-8.07 — електротрансформація штамів H. polymorpha ger1 та H. polymorpha leu1-1 плазмідами pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC, приготування поживних середовищ та лабораторного посуду для подальших експериментів;

9.07-12.07 — рестрикційний аналіз плазмід pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC, електротрансформація штамів H. polymorpha ger1 та H. polymorpha leu1-1 плазмідами pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC та pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC;

15.07-18.07 — перевірка наявності гена SUT1m в геномі отриманих рекомбінантних штамів за допомогою методу ПЛР.

19.07 — обрахунок отриманих результатів, оформлення звіту про проходження практики.

4. Вступ

Занепокоєння з приводу енергетичної безпеки, глобального постачання нафти і зміни клімату підвищили інтерес до виробництва рідкого біопалива з поновлюваних ресурсів. Етанол займає домінуюче положення серед поновлювального біопалива. Його використання обумовлено в основному високим рівнем його природного синтезу мікроорганізмами шляхом ферментації кукурудзяного крохмалю або цукрової тростини [4]. Найбільш оптимальним та перспективним є отримання біопаливного етанолу з поновлювальної та дешевої сировини, особливо з гідролізатів лігноцелюлозних відходів сільського господарства та деревообробної промисловості [6]. Найперспективнішими організмами для отримання етанолу з цукрів лігноцелюлози є дріжджі, зокрема термотолерантний вид Hansenula polymorpha [5].

Максимальна температура росту цього виду дріжджів становить 50 °С, що є абсолютним рекордом серед усіх дріжджів, і лише на 10 °С нижча максимальної температури росту відомих евкаріотичних організмів. Максимальна температура ферментації у H. рolymorpha (48 °С) має вперше уможливити проведення SSF процесу, тобто одночасної сахарифікації і ферментації глюкози та ксилози, оскільки ця температура близька до оптимальної для дії целюлаз і геміцелюлаз. [1]

Однак продуктивність процесу зброджування ксилози усіма відомими природними і лабораторними штамами мікроорганізмів є недостатньою для налагодження промислового виробництва. Таким чином, одержання дріжджових штамів з підвищеною продуктивністю алкогольної ферментації ксилози є важливим завданням, оскільки налагодження рентабельної технології отримання паливного етанолу з рослинної біомаси є головною передумовою для вирішення енергетичної, а також екологічної проблем у глобальному масштабі [3].

Завдяки попереднім дослідженням, проведеним в Інституті біології клітини НАН України, було сконструйовано глюкозно/ксилозний транспортер Sut1p Pichia stipitis із зміненими кінетичними властивостями. Ці зміни полягають в тому, що даний модифікований транспортер має або підвищену афінність до ксилози або знижену афінність до глюкози. Для того, щоб це перевірити було поставлене завдання, яке полягало у тому, щоб трансформувати штами H. polymorpha gcr1 та H. polymorpha leu1-1 двома плазмідами, що містять ген SUT1m. Плазміда pUC19_Gappr_SUT1m_Gaptr_NTC містить ген SUT1 під конститутивним промотором Gap, плазміда pUC19_Met25pr_SUT1m_Gaptr_NTC містить ген SUT1 під регульованим промотором Met25.

Завданнями наших досліджень були:

1) Перевірка коректності структури даних плазмід за допомогою рестрикційного аналізу

2) Електротрансформація штамів H. polymorpha gcr1 та H. polymorpha leu1-1 даними плазмідами

3) Перевірка наявності гена SUT1m в геномі отриманих рекомбінантних штамів за допомогою методу ПЛР