45. Плоскостная хроматография

В плоскостной хроматографии миграционной средой для разделяемых веществ служит сорбент, имеющий форму листа или пленки [32—36]. Для обозначения этого метода следует избегать термина «плоскослойная хроматография», поскольку он не отражает в должной мере того обстоятельства, что "в

большинстве случаев слой сорбента представляет собой пло­скость, т. е. имеет два измерения. В свое время широкое при­менение получила хроматография на фильтровальной бумаге (бумажная хроматография), однако впоследствии выяснилось, что, используя тонкоизмельченные сорбенты, можно получать более компактные зоны за меньшее время. В первоначальном варианте, называемом хроматографией в незакрепленном слое, порошок сорбента просто наносили на почти горизонтальную поверхность стеклянной пластинки. В настоящее время оба этих метода в значительной степени уступили свои позиции тонко­слойной хроматографии (ТСХ), которая отличается тем, что слой сорбента (чаще всего силикагеля с размером частиц 250 мкм) прочно связан (обычно с помощью гипса) с подлож­кой из стекла, пластмассы или алюминиевой фольги. Приме­няются также пластинки, полученные путем спекания сорбента на поверхности стекла [37]. Преимущество таких пластинок заключается в том, что после соответствующей регенерации их можно использовать повторно. Пластинки на основе стеклово­локна имеют торговую марку «Instant Thin-Layer Chromatog­raphy» (ITLC). Сорбенты для тонкослойной гель-хроматогра- фии наносят на подложку, не добавляя к ним связующего, по­этому угол наклона таких пластинок к горизонтальной поверх­ности должен быть не больше, чем это необходимо для .нисхо­дящего элюирования. Пластинки с закрепленным слоем обычно располагают вертикально, и подвижная фаза поднимается по слою сорбента под действием капиллярных сил.

В тех случаях, когда хроматографическим материалом яв­ляются полисахариды (бумага, декстрановый гель и т. п.), роль неподвижной фазы в действительности выполняет вода, т. е. реализуется принцип распределительной хроматографии. Иногда в ТСХ используют материалы, сорбционные свойства которых определенным образом меняются в направлении от одного края пластинки к другому (градиентные слои). Это ка­сается также бумажной хроматографии (например, можно со­здать градиент >рН).

Если разделение проводится в аналитических целях, образ­цы наносят в виде пятен (стартовые пятна), расположенных на некотором расстоянии от одного края прямоугольного листа или пластинки; если же разделение проводится в препаратив­ных целях, образцы наносят вдоль стартовой линии в виде по­лосок, параллельных краю листа. В последнем случае для на­несения образца часто используют специальные приспособления (например, автоматический аппликатор). Наносить вещество на тонкослойную пластинку можно также путем конденсации фракций, получаемых при газохроматографическом разделе­нии, или из нагретого патрона с образцом (термофрактогра-

фия). Хроматограммы элюируют и закрытых сосудах (камерах). Лист бумаги или пластинку помещают в камеру таким образом, чтобы тот край, вблизи от которого нанесено вещество, был погружен в растворитель. При движении элюента образуется граница между смоченной и несмоченной поверхностью сорбен­та (фронт растворителя), которая перемещается параллельно •стартовой линии и в конечном итоге достигает противополож­ной стороны хроматограммы. Лист фильтровальной бумаги может иметь форму цилиндра или кольца, а слой порошкооб­разного сорбента может быть нанесен на ловерхность палочки (хромарод, хроматобар) или на внутреннюю поверхность труб­ки. Для плоскостной хроматографии используются даже во­локнистые сорбенты (например, шелк).

Одно из преимуществ .плоскостной хроматографии состоит в том, что хроматографировать можно одновременно несколько ■образцов, что экономит время и позволяет в рамках одного эксперимента сравнивать свойства различных препаратов. Раз­решающую способность можно увеличить, обеспечив непрерыв­ное движение растворителя в слое сорбента (проточное элюи­рование) или повторяя хроматографирование несколько раз (программированное многократное элюирование). Образец, на­несенный вблизи одного из углов квадратной пластинки, можно последовательно элюировать в двух взаимно перпендикулярных направлениях (двумерная хроматография).

В круговой хроматографии элюирование осуществляется в направлении от центра к периферии слоя сорбента. Образец наносят в виде дуги или кольца вокруг центра хроматограм­мы, куда затем подают растворитель. Полученные с помощью этого метода хроматографические зоны представляют собой концентрические дуги или окружности, расположенные на раз­личном удалении от центрального пятна. Если хроматографи­рование в плоском слое сорбента осуществляется таким же об­разом, как в классической колоночной хроматографии, метод непрерывного элюирования соответствует простому элюирова- нию с колонки, многократное элюирование — хроматографии с повторяющимся циклом, а радиальное элюирование — центри­фужной колоночной хроматографии. Следует отметить, что под действием центробежной силы скорость радиального элюирова­ния плоских хроматограмм увеличивается; .для создания такой силы используют приспособление типа фонографа.

С уменьшением свободного пространства над слоем сорбен­та возрастает скорость элюирования, а картина разделения становится более четкой и воспроизводимой. Это достигается в хроматографических камерах специальной конструкции (напри­мер, в камерах типа «сандвич» или камерах Бреннера — Нидер- визера). Высокоэффективная ТСХ [38] обеспечивает высокую

скорость, чувствительность и воспроизводимость анализа при. условии строгого соблюдения постоянства скорости элюирова­ния и состава неподвижной и газовой фазы. Известен также метод ТСХ с программированным изменением состава паров подвижной фазы вдоль поверхности слоя сорбента.

Растворитель Старт

 

аййаааааашй

в в

Рис. 1.4. Разделение компонентов смеси в непрерывном потоке раствора

образца.

Образец непрерывно подается на медленно вращающийся лист бумаги цилиндрической формы, орошаемый нисходящим потоком элюента. Индивидуальные компоненты смеси (А, Б и В) образуют при этом полосы. Если бы образец хроматоерафировали на не­подвижном листе бумаги, то в моменты времени tt—<п зоны занимали бы положения, обозначенные эллипсами внутри заштрихованных полос. Стекающий с бумаги элюат попадает в специальные стационарные сосуды для сбора фракций.

Для обнаружения бесцветных веществ на бумажных или тонкослойных хроматограммах используют методы неразру- шающего контроля (например, УФ-облучение или выдержива­ние в атмосфере, насыщенной парами иода), а также обработ­ку (в частности, опрыскивание) хроматограмм более или менее специфическими обнаруживающими реагентами. До или после обнаружения зон присутствующие в них вещества можно со­ответствующим образом элюировать и далее использовать, на­пример, для количественного анализа.

Поглощающие свет или флуоресцирующие зоны можно об­наруживать при помощи автоматического сканирующего денси-

тометра {34], который позволяет представить результаты ана­лиза в виде соответствующей кривой (см., например, рис. 1.2,6). Аналогичным образом можно обработать хроматограммы, со­держащие радиоактивные зоны. Радиоактивные вещества об­наруживают также, используя метод радиоавтографии, суть которого заключается в том, что на фотографической пленке, прижатой эмульсионным слоем к поверхности хроматограммы, экспонируются участки, соответствующие радиоактивным зо­нам. После обработки такой пленки получают точную копию хроматограммы, на которой радиоактивные зоны представлены темными пятнами. Для обнаружения биологически активных веществ, например антибиотиков, используют чувствительные к этим веществам микроорганизмы (биоавтография). Если хро­матограммы имеют цилиндрическую форму (слой сорбента на­несен на поверхность палочки или иа внутреннюю поверхность трубки), их можно пропустить через круговую печь и обнару­жить испаряющиеся вещества, используя детекторы, применяе­мые в газовой хроматографии.

Методом жидкостной хроматографии за один прием обычно разделяют лишь ограниченное количество образца. Если же сорбентом служит медленно вращающийся цилиндр из хрома- тографической бумаги, разделение можно проводить в непре­рывном режиме {40] (см. рис. 1.4). Из неподвижного апплика­тора, расположенного вблизи верхней кромки цилиндра, раствор анализируемого образца непрерывно подают на бумагу, оро­шаемую нисходящим потоком элюента. Стекающий по бумаге растворитель, достигнув ее нижнего края, скапывает в непо­движные сосуды. Выбор подходящей скорости вращения ци­линдра относительно коллектора обеспечивает четкое фракцио­нирование смеси веществ. Представленное на рис. 1.4 разделе­ние компонентов смеси на несколько «потоков» является ре­зультатом сложения двух сил, одна из которых стремится пере­местить вещество в горизонтальном направлении (обусловлена вращением бумаги), а другая — в вертикальном (нисходящий поток растворителя).

46. Ионообменная хроматография является более частным вариантом ионной хроматографии. Этот вариант хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, на основании зарядовразделяемых молекул.

Данный вид хроматографии позволяет разделить практически любые заряженные молекулы, в том числе: крупные — белки, малые—молекулы нуклеотидов и аминокислот. Часто ионообменную хроматографию используют как первый этап очистки белков.