V. Предварительная подготовка срезов к окрашиванию

Перед тем, как приступать к окрашиванию срезов, их, как правило, подвергают предварительной обработке, характер которой зависит от методов фиксации, уплотнения материала и приготовления срезов.

Парафиновые срезы требуют наиболее сложной подготовки. Так как парафин не обладает достаточной прозрачностью и затрудняет процесс окрашивания (гистологические красители – это водные или спиртовые растворы, плохо проникающие в парафинированные ткани), его необходимо удалять из среза. Для этого срез подвергают депарафинированию – процессу, обратному тому, который осуществляют при подготовке объекта к заливке в парафин, т.е. срезы последовательно проводят через растворитель парафина, спирты нисходящей концентрации и помещают в воду. Практически это осуществляют так. Этикетируют бюксы, наливают в них соответствующие растворы и устанавливают в определенной последовательности:

Ксилол (бензол, толуол)	две смены	по 2-4 мин.
Спирт 96%	две смены	по 2-3 мин.
Спирт 70%		2-3 мин.
Вода дистиллированная	две смены	по 2 мин. и больше.

Можно одну смену 96% спирта заменить порцией абсолютного спирта, а вместо 70% применить 80% или 60% спирт. Важно сохранять лишь принципиальную схему.

Для ускорения растворения парафина предметные стёкла покачивают или подогревают ксилол.

После удаления парафина и проведения через спирты нисходящей концентрации стёкла со срезами быстро переносят в воду, погружая сразу на дно чашки с водой. При медленном погружении срез иногда может отскочить от предметного стекла вследствие резкого изменения поверхностного натяжения, которое возникает на поверхности воды при соприкосновении со срезом, пропитанным спиртом.

В воде срезы оставляют на 1-2 минуты, т.е. до тех пор, пока они хорошо отмоются. Преждевременное извлечение препарата из воды, когда спирт ещё может оставаться в срезе, сопряжено с таким же риском, как и только что отмеченное медленное погружение в воду. При хорошем удалении парафина и ксилола вокруг среза в воде не должно образоваться никакой мути, в противном случае его нужно ещё раз обработать спиртом, так как образовавшая эмульсия будет препятствовать окрашиванию.

Целлоидиновые среды можно окрашивать без предварительного удаления целлоидина, помещая пред крашением в дистиллированную воду. Если краситель окрашивает целлоидин, то последний удаляют в смеси абсолютного спирта с эфиром (1:1), после чего обрабатывают так же, как при депарафинировании (спирты нисходящей концентрации - вода).

Желатиновые срезы освобождают от желатина (т.к. он окрашивается красителями), помещая в слегка подкисленную дистиллированную воду, подогретую до 37⁰С. Если блок хранился в формалине, то удалить желатин невозможно, и это может затруднить микроскопирование.

Замороженные срезы не нуждаются в предварительной обработке, т.к. обычно при резке их собирают в дистиллированную воду.

Иногда перед крашением производят избавление от примесей, например, после фиксации в сулеме. Осадки сулемы удаляют после депарафинирования. Срезы из воды переносят в раствор Люголя, разбавленный вдвое (состав раствора Люголя: йода металлического 1 г, йодистого калия 2г, воды дистиллированной 100 мл.). Срез обрабатывают не менее 10 мин. (до тех пор, пока не исчезнет осадок сулемы, имеющий вид черных кристаллов, что контролируют, микроскопируя срезы при слабом увеличении). Затем для удаления йода, придающего срезам желтый цвет, их обрабатывают 0,25% водным раствором натрия гипосульфита в течение 3-5 мин., промывают 30 мин водопроводной водой и переносят в дистиллированную.

Удаление осадков формалина проводят только в случаях, когда их очень много. Срезы после депарафинирования в течение 10 мин. выдерживают в смеси: 1 часть 1% раствора калия гидроксида и 100 частей 80% спирта, а затем промывают 80% спиртом и проточной водой.

Если срезы в процессе дальнейшей обработки отклеиваются от стекол (при применении ярко выраженных кислых или щелочных растворов или недостаточно прочном приклеивании), то это можно исправить, применив целлоидиновую защиту.

Для этого срез из воды помещают последовательно в 70% и 96% спирт, затем стекло опускают в 0,5 -1% раствор целлоидина, вынимают, дают подсохнуть (не до полного высыхания!) и помещают в 70% спирт. В результате срез покрывается тонкой целлоидиновой пленкой, благодаря которой и достигается укрепление среза на стекла. После этого срез промывают в дистиллированной воде и окрашивают.