IgA, IgG, IgM: методы определения, непрямаяиммунофлюоресценция

Непрямаяиммунофлюоресценция - метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.

IgA, IgG, IgM: методы определения, реакция агглютинации

Методы, основанные на реакции агглютинации. Для реакции агглютинации обычно используют эритроциты (гемагглютинация) или частицы латекса (латекс-агглютинация), покрытые известным антигеном. В присутствии антител к этому антигену происходит агглютинация эритроцитов или частиц латекса.

Гемагглютинация применяется для выявления антител к тиреоглобулину и микросомальным антителам, латекс-агглютинация - для выявления ревматоидного фактора и некоторых других антител. Эти методы просты и позволяют количественно определить антиген, однако менее чувствительны, чем радиоимунный и твердофазный иммуноферментный анализы.

IgE: методы определения

Определение общего уровня IgE обычно проводят с помощью радиоиммунного анализа , поскольку низкое содержание этого иммуноглобулина не позволяет использовать те методы, которые применяются для определения IgG, IgA и IgM.

Количественную оценку IgE проводят таким образом:

- исследованную пробу добавляют к сорбированным на твердой подложке антителам против IgE;

- после отмывания от несвязанного IgE добавляют меченные изотопом антитела к IgE;

- после отмывания от несвязанных антител по уровню радиоактивности определяют количество IgE в исследуемой пробе.

39. Комплекс реакций, основанных на феномене взаимодействия «антиген-антитело». Серологические методы исследования: характеристика, области применения. Реакции агглютинации и преципитации. Гемагглютинация, ее разновидности и аспекты применения.

Реакции между антигенами и антителами invitro, имеющие диагностическое значение, называли серологическими (от лат. sеrum - сыворотка), так как источником антител служила сыворотка крови. При появлении методов иммунохимического анализа серологические реакции стали одной из широкого набора реакций, выявляющих механизмы взаимодействия между антигенами и антителами. Если на разных этапах развития иммунологии в качестве антител для постановки серологических реакций использовали только сыворотку крови, теперь благодаря разнообразным методам выделяют из нее высокоочищенные иммуноглобулины.для индикации и количественной оценки того или иного вещества антигенной природы предложены способы получения высокоспецифичных (моноспецифичных) антител и высокочувствительные методы регистрации концентрации отдельных компонентов реакции антиген - антитело. Антитела в зависимости от свойств антигена и условий взаимодействия с ним обладают нейтрализующим, иммобилизирующим, коагулирующим (осаждающим) и лизирующим (растворяющим) действиями. Нейтрализующее действие проявляется в реакциях нейтрализации токсина антитоксином, иммобилизирующее - в иммобилизации некоторых микроорганизмов, коагулирующее - в реакциях агглютинации и преципитации, лизирующее - в реакциях лизиса и связывания комплемента. Каждая из разновидностей серологических реакций имеет свои варианты, а их постановка - различные модификации, поэтому методические подходы к проведению реакций между антигеном и антителом довольно разнообразны. Реакция нейтрализации (РН). В ходе реакции нейтрализации специфические антитела нейтрализуют вредное действие антигена, которое проявляется при попадании последнего в организм. Если антигеном служит микробный экзотоксин (дифтерийный, столбнячный, ботулинический и др.), то специфические антитела нейтрализуют его. В организме происходит нейтрализация только свободного, не связавшегося с клетками токсина. Обезвреживание токсина в ходе физико-химической реакции нейтрализации происходит за счет связывания его свободных аминогрупп, что приводит к потере токсичности. Реакция агглютинации (РА). Различают прямую и непрямую, или пассивную, агглютинации. В прямой агглютинации в качестве антигена выступает сама микробная клетка или структурные компоненты ее поверхностной оболочки. Агглютинация обусловлена в большей степени особенностями строения клеточной оболочки и ее функциями, нежели свойствами агглютининов. Fab-фрагменты антител могут блокировать антигенные детерминанты, не приводя непосредственно к склеиванию. Агглютинации способствует расположение антигенных рецепторов клеточной поверхности в виде скоплений. При пассивной агглютинации растворимые антигены (белки, полисахариды и их комплексы микробного происхождения) со­единяются с нерастворимым носителем, выполняющим исключительно индикаторную функцию. Носителями могут быть эритро­циты, частицы латекса, полиакриламида, бентонита и др. Связывание антигена с носителем происходит в результате адсорбции или химического взаимодействия. Микробные полисахариды, например, адсорбируются на нативных эритроцитах без какой-либо их предварительной обработки.Обработка предотвращает разрушение эритроцитов, которое может про изойти при непосредственном их контакте с антигеном. При условии, если антиген, связанный с носителем, соответствует антителу, происходит агглютинация. Реакция преципитации (РП). Реакция антиген-антитело представлена преципитацией. Основана на осаждении антигена из раствора специфическими антителами. Комплекс антиген - антитело выпадает в осадок только при определенных соотношениях концентраций реагирующих молекул. Область этих соотношений, при которых в надосадочной жидкости после образований преципитата не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела, называется зоной эквивалентности. Вне этой зоны, при избытке антител или антигена, феномен преципитации не происходит, так как образуется растворимый комплекс антиген - антитело. Реакция преципитации менее чувствительна, чем реакция агглютинации. Реакция лизиса (РЛ).Лизирующее (растворяющее) действие антител наглядно проявляется в реакциях лизиса и связывания комплемента. В основе реакций лизиса лежит взаимодействие корпускулярных антигенов со специфическими антителами. Реакция связывания комплемента  (РСК). Механизм действия наиболее сложный в сравнении с другими серологическими реакциями. В РСК участвуют две системы антиген - антитело. Для визуальной регистрации связывания комплемента основной системой антиген - антитело в реакцию дополнительно вводят вторую, или индикаторную, систему, состоящую из взвеси эритроцитов и соответствующей антисыворотки (гемолитической сыворотки). Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). В основу иммунофлуоресцентного метода положено взаимодействие антигена с антителом, при котором один из компонентов реакции (чаще антитело) обладает способностью к вторичной флуоресценции благодаря предварительному соединению с флуоресцентным красителем. Образовавшиеся таким образом иммунные комплексы становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами на темном фоне под флуоресцентным микроскопом. В качестве флуоресцентных красителей используют флуоресцеин, изотиоцианат, родамин.