IgA, IgG, IgM: методы определения, радиальнаяиммунодиффузия

Двойная радиальная иммунодиффузия - полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними. Суть метода заключается в следующем:

- в лунки, вырезанные в агаре, вносят исследуемую смесь антигенов и антитела с известной специфичностью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в расположенные вокруг нее - антигены);

- антигены и антитела диффундируют по направлению друг к другу;

- в том месте, где произошло связывание антител и антигенов, образуются полосы преципитации. По взаимному расположению и форме полос преципитации можно оценить степень сходства между антигенами, находящимися в соседних лунках. В настоящее время этот метод применяется в диагностике аутоиммунных заболеваний для выявления аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам. Хотя по чувствительности метод двойной радиальной иммунодиффузии уступает многим количественным методам, технически он прост, не требует высокоочищенных антител, специфичен и может использоваться при проведении массовых исследований.

IgA, IgG, IgM: методы определения, нефелометрия

Нефелометрия - определение концентрации взвешенных частиц и высокомолекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света, проходящего через этот раствор. Нефелометрия может быть использована для определения концентрации антигенов, поскольку при добавлении к ним антител образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет. Нефелометрия позволяет с высокой точностью определить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, C3, С4, фактора В, С-реактивного белка и некоторых других сывороточных белков. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. В настоящее время многие лаборатории используют нефелометрию в качестве стандартного метода количественного определения иммуноглобулинов.

IgA, IgG, IgM: методы определения, радиоиммунный анализ

уть метода заключается в следующем:

- известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена).

- антиген, содержащийся в пробе, и стандартные меченые антигены связываются с антителами;

- чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами ( рис. 20.4 ).

Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов.

Тот же подход может быть использовани для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивается с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител).

Основные недостатки метода - необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий работы с радиоактивными изотопами.

IgA, IgG, IgM: методы определения, иммуноферментный анализ

Твердофазный иммуноферментный анализ применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с радиоиммунным анализом, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофазпый иммуноферментный анализ в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).

IgA, IgG, IgM: методы определения, иммуноблоттинг Иммуноблоттинг - качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом:

- смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану;

- мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем - с мечеными антителами к иммуноглобулинам.

Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного иммуноферментного анализа при диагностике ВИЧ- инфекции.