Иммунология

1.Луи Пастер и его роль в развитии микробиологии. Разработка Пастером научных основ специфической профилактики инфекционных болезней.

Пастер сделал ряд выдающихся от­крытий. За короткий период с 1857 по 1885 г. он доказал, что брожение (молочнокислое, спиртовое, уксуснокислое) не явля­ется химическим процессом, а его вызывают микроорганизмы; опроверг теорию самозарождения; открыл явление анаэробио­за, т.е. возможность жизни микроорганизмов в отсутствие кис­лорода; заложил основы дезинфекции, асептики и антисепти­ки; открыл способ предохранения от инфекционных болезней с помощью вакцинации.

Многие открытия Л. Пастера принесли человечеству огром­ную практическую пользу. Путем прогревания (пастеризации) были побеждены болезни пива и вина, молочнокислых продук­тов, вызываемые микроорганизмами; для предупреждения гной­ных осложнений ран введена антисептика; на основе принципов Л. Пастера разработаны многие вакцины для борьбы с инфекционными болезнями.

Однако значение трудов Л. Пастера выходит далеко за рамки только этих практических достижений. Л. Пастер вывел микро­биологию и иммунологию на принципиально новые позиции, показал роль микроорганизмов в жизни людей, экономике, про­мышленности, инфекционной патологии, заложил принципы, по которым развиваются микробиология и иммунология и в наше время.

Л. Пастер был, кроме того, выдающимся учителем и органи­затором науки.

Работы Л. Пастера по вакцинации открыли новый этап в раз­витии микробиологии, по праву получивший название имму­нологического.

Принцип аттенуации (ослабления) микроорганизмов с помо­щью пассажей через восприимчивое животное или при выдерживании микроорганизмов в неблагоприятных условиях (темпе­ратура, высушивание) позволил Л. Пастеру получить вакцины против бешенства, сибирской язвы, куриной холеры; этот прин­цип до настоящего времени используется при приготовлении вакцин. Следовательно, Л. Пастер является основоположником научной иммунологии, хотя и до него был известен метод пре­дупреждения оспы путем заражения людей коровьей оспой, разработанный английским врачом Э. Дженнером. Однако этот метод не был распространен на профилактику других болезней.

Роберт Кох. Физиологический период в развитии микробиологии связан также с именем немецкого ученого Роберта Коха, которому при­надлежит разработка методов получения чистых культур бактерий, окраски бактерий при микроскопии, микрофотографии. Известна также сформулированная Р. Кохом триада Коха, которой до сих пор пользуются при установлении возбудителя болезни.

2. Виды иммунитета. Приобретенный иммунитет, пассивный и активный иммунитет. Нейро-гуморальные механизмы регуляции продукции антител (гипоталамо-гипофизо-адренокортикальная система).

Существуют две основные формы противоинфекционного иммунитета. Первая — видовой, или врожденный (наследственный), или неспецифический, иммунитет. Вторая — приобретенный, или специфический, иммунитет.

Приобретенный иммунитет отличается от видового следующими особенностями.

-Во-первых, он не передается по наследству. По наследству передается лишь ин­формация об органе иммунитета, а сам иммунитет формируется в процессе индиви­дуальной жизни в результате взаимодействия с соответствующими возбудителями или их антигенами.

-Во-вторых, приобретенный иммунитет является строго специфическим, т. е. все­гда направлен против конкретного возбудителя или антигена.

Форми­рование приобретенного специфического иммунитета происходит благодаря коопера­тивному взаимодействию макрофагов (и других антигенпредставляющих клеток), В- и Т-лимфоцитов и при активном участии всех остальных иммунных систем.

-Активно приобретенный иммунитет, особенно постинфекционный, устанавлива­ется спустя некоторое время после заболевания или прививки (1—2 нед.), сохраня­ется долго — годами, десятилетиями, иногда пожизненно (корь, оспа, туляремия).

-Пассивный иммунитет создается очень быстро, сразу после введения иммунной сы­воротки, но зато сохраняется очень недолго (несколько недель) и снижается по ме­ре исчезновения введенных в организм антител.

Существуют по крайней мере три системы регуляции продукции антител, или, в более широком плане, силы иммунного ответа. Одна из них действует на генетиче­ском уровне, другая — на нейрогуморальном. Не исключено, что вторая подчинена первой. Давно было замечено, что введение одного и того же антигена индуцирует у разных индивидуумов данного вида появление различного количества антител: от нуля до высокого уровня.

Вместе с тем продукция антител регулируется и симпатико-адреналовой систе­мой. Показано, что генерализованное возбуждение медиальных зон гипоталамуса ведет к резкому усилению продукции антител. Такой же эффект вызывает гормон роста, образуемый гипофизом.

Третья система регуляции содержания антител связана с идиотип-антиидиотипическими отношениями.

3. Видовой иммунитет (резистентность). Физиологические механизмы, лежащие в основе видовой резистентности. Гуморальные факторы видового иммунитета - комплемент, его свойства, природа, состав; пропердин.

Под видовым иммунитетом понимают невосприимчивость, обусловленную врожденными биологическими особенностями, присущими данному виду животных или человеку. В основе видового иммунитета лежат различные механизмы естественной неспецифической резистентности. Характерными особенностями ее являются наслед­ственная передача и отсутствие специфичности. Неспецифическая видовая резистентность обусловлена целым рядом анатомо- физиологических механизмов. Схематически их можно разделить на следующие группы факторов: защитная роль кожных и слизистых покровов; нормальная мик­рофлора макроорганизма; воспаление; лихорадка; барьерная функция лимфатичес­ких узлов; гуморальные антимикробные вещества, содержащиеся в тканях и жидко­стях организма; функции выделительной системы; фагоцитоз и др.

Природа и характеристика комплемента. Комплемент является одним из важных фак­торов гуморального иммунитета, играющим роль в защите организма от антигенов. Комплемент представляет со­бой сложный комплекс белков сыворотки крови, находящийся обычно в неактивном состоянии и активирующийся при соедине­нии антигена с антителом или при агрега­ции антигена.

1. Девять белков, составляющих собственно комплемент и обозначаемых поэто­му буквой С: С1...С9, причем С1-компонент состоит из трех белковых субъединиц (С1q, С1г, С1s), все остальные представляют собой единичные белковые молекулы. В составе молекулы имеется рецептор для связывания с Рс-фрагментом молеку­лы антитела. Антитела, относящиеся к иммуноглобулинам различных классов, вза­имодействуют с комплементами с различной степенью активности. Белки С5, С6, С7, С8 и С9 участвуют в организации мембрано-атакующего комплекса.

2. Регуляторные белки: С1Е1, С4bр, фактор Н, фактор I (инактиватор СЗb/С4b), белок S.

3. Факторы, участвующие в альтернативном пути активации системы комплемента: фактор В (протеиназа), фактор В (гликопротеин), фактор Р (пропердин) — у-глобулин, его обнаружил в 1954 г. Л. Пиллемер. Этот белок, образуя комплекс с эндоток­сином, в присутствии ионов Mg разрушает С3, поэтому был назван пропердином. Пропердин стабилизирует СЗ-конвертазу альтернативного пути.

4. Комплемент, состав, основные свойства. Пути активации. Участие комплемента в реакциях иммунитета. РСК, методика ее постановки и практическое использование.

Комплемент является одним из важных фак­торов гуморального иммунитета, играющим роль в защите организма от антигенов. Комплемент представляет со­бой сложный комплекс белков сыворотки крови, находящийся обычно в неактивном состоянии и активирующийся при соедине­нии антигена с антителом или при агрега­ции антигена.

Состав:

1. Девять белков, составляющих собственно комплемент и обозначаемых поэто­му буквой С: С1...С9, причем С1-компонент состоит из трех белковых субъединиц (С1q, С1г, С1s), все остальные представляют собой единичные белковые молекулы. В составе молекулы имеется рецептор для связывания с Рс-фрагментом молеку­лы антитела. Антитела, относящиеся к иммуноглобулинам различных классов, вза­имодействуют с комплементами с различной степенью активности. Белки С5, С6, С7, С8 и С9 участвуют в организации мембрано-атакующего комплекса.

2. Регуляторные белки: С1Е1, С4bр, фактор Н, фактор I (инактиватор СЗb/С4b), белок S.

3. Факторы, участвующие в альтернативном пути активации системы комплемента: фактор В (протеиназа), фактор В (гликопротеин), фактор Р (пропердин) — у-глобулин, его обнаружил в 1954 г. Л. Пиллемер. Этот белок, образуя комплекс с эндоток­сином, в присутствии ионов Mg разрушает С3, поэтому был назван пропердином. Пропердин стабилизирует СЗ-конвертазу альтернативного пути.

Функции комплемента многообразны: а) участвует в лизисе микробных и других клеток (цитотоксическое действие); б) обладает хемотаксической активностью; в) принимает учас­тие в анафилаксии; г) участвует в фагоцитозе. Следовательно, комплемент является компонен­том многих иммунологических реакций, направ­ленных на освобождение организма от микробов и других чужеродных клеток и антигенов (на­пример, опухолевых клеток, трансплантата).

Механизм активации комплемента представляет собой каскад фер­ментативных протеолитических реакций, в результате которого образуется активный цитолитический комплекс, разрушающий стен­ку бактерии и других клеток. Известны три пути активации комплемента: классический, альтернативный и лектиновый.

По классическому пути комплемент активирует­ся комплексом антиген-антитело. Для этого достаточно участия в связывании антигена одной молекулы IgM или двух молекул IgG. Процесс начинается с присоединения к ком­плексу АГ+АТ компонента С1, который рас­падается на субъединицы Clq, Clr и Сls. Далее в реакции участвуют последовательно активированные «ранние» компоненты комплемента в такой последовательности: С4, С2, СЗ. Эта реакция имеет характер усиливающе­гося каскада, т. е. когда одна молекула пре­дыдущего компонента активирует несколько молекул последующего. «Ранний» компонент комплемента С3 активирует компонент С5, который обладает свойством прикрепляться к мембране клетки. На компоненте С5 путем последовательного присоединения «поздних» компонентов С6, С7, С8, С9 образуется литический или мембраноатакующий комплекс который нарушает целостность мембраны (образует в ней отверстие), и клетка погибает в результате осмотического лизиса.

Альтернативный путь активации комплемен­та проходит без участия антител. Этот путь характерен для защиты от грамотрицательных микробов. Каскадная цепная реакция при аль­тернативном пути начинается с взаимодействия антигена (например, полисахарида) с протеи­нами В, D и пропердином (Р) с последующей активацией компонента СЗ. Далее реакция идет так же, как и при классическом пути — образу­ется мембраноатакующий комплекс.

Лектиновыи путь активации комплемента также происходит без участия антител. Он ини­циируется особым маннозосвязывающим белком сыворотки крови, который после взаимодейс­твия с остатками маннозы на поверхности мик­робных клеток катализирует С4. Дальнейший каскад реакций сходен с классическим путем.

В процессе активации комплемента обра­зуются продукты протеолиза его компонен­тов — субъединицы СЗа и СЗb, С5а и С5b и дру­гие, которые обладают высокой биологической активностью. Например, СЗа и С5а принимают участие в анафилактических реакциях, являют­ся хемоаттрактантами, СЗb — играет роль в опсонизации объектов фагоцитоза, и т. д. Сложная каскадная реакция комплемента происходит с участием ионов Са²⁺ и Mg²⁺.

Реакция связывания комплемента.

Уникальная способность комплемента специфически связываться с различными по своей природе комплексами антиген + антитело нашла широкое применение в реакции связывания комплемента (РСК). Особое преимущество РСК состоит в том, что природа антигена, участвующего в ней (корпускулярный или раствори­мый), не имеет значения, так как комплемент связывается с Fс-фрагментом лю­бого антитела, относящегося к IgG и IgМ, независимо от его антительной специ­фичности. Кроме того, РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем, например, в реакции преципитации. РСК была предложена в 1901 г. Ж. Борде и О. Жангу. В ее основе лежат два свой­ства комплемента:

1. способность связываться с комплексом антиген + антитело;

2. лизирование эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки.

РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы — опыт­ная, или диагностическая, и индикаторная. Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реак­ции прогревают при 56 °С в течение 30 мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и антигена. К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь ин­кубируют при 37 "С в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеют­ся антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном, и образую­щиеся комплексы антиген + антитело свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке антитела отсутствуют, образования комплекса антиген + антитело не произойдет, и комплемент останется свободным. Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяс­нения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроци­ты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37С в течение 30—60 мин, после чего оценивают результаты реакции. В случае, если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются антитела, и произошло связывание комплемента комплексом антитело + + антиген, лизиса эритроцитов не будет — РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов. Если же в сыворотке специфические антите­ла отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произой­дет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе Комплемент связывается с комплексом эритроциты + антитела индикаторной системы и произойдет гемолиз: в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровожда­ется соответствующими контролями: контроль сыворотки (без антигена) и конт­роль антигена (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые антигены обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компо­ненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или антигена, подвергаются тщательному титрованию. Особенно важно ввести в реакцию точ­ную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к лож­ным результатам. Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20—25 % по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, кото­рое, будучи смешано с равным объемом 10 % раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при температуре 37 °С. В основной опыт берут сыворотку, разведенную до 1/3 своего титра.

Непрямая реакция гемолиза используется как ускоренный метод обнаруже­ния специфических антител. В качестве носителя антигенов используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических антител сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.

5. Приобретенный иммунитет. Значение антител в формировании иммунитета. Роль различных классов иммуноглобулинов в иммунологических реакциях (агглютинации, РСК, нейтрализации токсинов и вирусов, развитии местного иммунитет).

Приобретенный иммунитет отличается от видового следующими особенностями.

-Во-первых, он не передается по наследству. По наследству передается лишь ин­формация об органе иммунитета, а сам иммунитет формируется в процессе индиви­дуальной жизни в результате взаимодействия с соответствующими возбудителями или их антигенами.

-Во-вторых, приобретенный иммунитет является строго специфическим, т. е. все­гда направлен против конкретного возбудителя или антигена.

Форми­рование приобретенного специфического иммунитета происходит благодаря коопера­тивному взаимодействию макрофагов (и других антигенпредставляющих клеток), В- и Т-лимфоцитов и при активном участии всех остальных иммунных систем.

Одним из характерных признаков приобретенного иммунитета служит появление в сыворотке крови и тканевых соках специфических защитных веществ — антител, направленных против чужеродных веществ.

Антитела являются уникальными сывороточными белками — глобулинами, ко­торые вырабатываются в ответ на поступление в организм антигена и способны с ним специфически взаимодействовать. Совокупность сывороточ­ных белков, обладающих свойствами антител, называют иммуноглобулинами и обозначают символом Ig.

Существует пять различных классов иммуногло­булинов: IgG, IgМ, IgА, IgЕ, IgD Они различаются по молекулярной массе, содержа­нию углеводов, составу полипептидных цепей, коэффициентам седиментации и др.

Высокая нейтрализующая активность антител, принадлежащих к IgG, свидетель­ствует о важной роли их в антитоксическом иммунитете. Антитела IgМ особенно активны в реакциях фагоцитоза с корпускулярными антигенами и поэтому играют существенную роль в антимикробном иммунитете, В реакциях нейтрализации виру­сов особенно активны антитела IgА, следовательно, им принадлежит большая роль в противовирусном иммунитете. Кроме того, секреторные IgAs обусловливают мест­ный иммунитет слизистых оболочек. Наконец, антитела IgЕ, обладающие гомоцитотропностью, опосредуют реакции гиперчувствительности немедленного типа.

Реакция связывания комплемента.

Уникальная способность комплемента специфически связываться с различными по своей природе комплексами антиген + антитело нашла широкое применение в реакции связывания комплемента (РСК). Особое преимущество РСК состоит в том, что природа антигена, участвующего в ней (корпускулярный или раствори­мый), не имеет значения, так как комплемент связывается с Fс-фрагментом лю­бого антитела, относящегося к IgG и IgМ, независимо от его антительной специ­фичности. Кроме того, РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем, например, в реакции преципитации. РСК была предложена в 1901 г. Ж. Борде и О. Жангу. В ее основе лежат два свой­ства комплемента:

3. способность связываться с комплексом антиген + антитело;

4. лизирование эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки.

РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы — опыт­ная, или диагностическая, и индикаторная. Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реак­ции прогревают при 56 °С в течение 30 мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и антигена. К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь ин­кубируют при 37С в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеют­ся антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном, и образую­щиеся комплексы антиген + антитело свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке антитела отсутствуют, образования комплекса антиген + антитело не произойдет, и комплемент останется свободным. Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяс­нения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроци­ты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37С в течение 30—60 мин, после чего оценивают результаты реакции. В случае, если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются антитела, и произошло связывание комплемента комплексом антитело + + антиген, лизиса эритроцитов не будет — РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов. Если же в сыворотке специфические антите­ла отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произой­дет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе Комплемент связывается с комплексом эритроциты + антитела индикаторной системы и произойдет гемолиз: в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровожда­ется соответствующими контролями: контроль сыворотки (без антигена) и конт­роль антигена (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые антигены обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компо­ненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или антигена, подвергаются тщательному титрованию. Особенно важно ввести в реакцию точ­ную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к лож­ным результатам. Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20—25 % по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, кото­рое, будучи смешано с равным объемом 10 % раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при температуре 37 °С. В основной опыт берут сыворотку, разведенную до 1/3 своего титра.

Непрямая реакция гемолиза используется как ускоренный метод обнаруже­ния специфических антител. В качестве носителя антигенов используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических антител сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.

6. Антигены. Определение понятия, свойства, химическая природа. Специфичное антигенов. Детерминантная группа (эпитоп), шлеппер. Полноценные и неполноценные антигены. Гаптены и полугаптены. Факторы, определяющие антигенность белка и ее специфичность.

Антигены — любые вещества, содержащиеся в микроорганизмах и других клетках или выделяемые ими, которые несут признаки генетически чуже­родной информации и при введении в организм вызывают развитие специфи­ческих иммунных реакций.

Реализация антигенности зависит от способности антиге­на метаболизироваться в организме, т. е. быть объектом разрушающего действия макрофагов и взаимодействовать с другими клетками иммунной системы. Благода­ря такому взаимодействию происходит распознавание антигенной специфичности. Все антигены обладают специфичностью, т. е. определенными особенностями, гене­тически детерминированными и связанными с их структурой, почему они и отлича­ются друг от друга.

Для характеристики микроорганизмов помимо родовой, видовой и групповой антигенной специфичности очень важное значение имеет определение типоспецифичности антигенов. Типоспецифичность — особенность антигенного строения, которая обусловливает различия среди особей одной группы сходных организмов данного вида и позволяет выделить среди них серотипы, или сероварианты (серовары). Выявление сероваров дает возможность осуществлять очень тонкую дифферен­циацию внутри вида микроорганизмов.

Большинство современных классификаций патогенных микроорганизмов по­строены с учетом этих типов антигенной специфичности.

Изучение антигенных свойств различных сложных химических соединений — белков, полисахаридов, липидов, нуклеиновых кислот и т. д. — показало, что суще­ствует два типа антигенов — полноценные и неполноценные.

-Полноценные антигены обладают обеими функциями антигена: способностью индуцировать образование антител и специфически с ними взаимодействовать.

-Неполноценные антигены сами по себе способностью индуцировать образование антител не обладают, они приоб­ретают это свойство только после соединения с белками или другими полноценными антигенами. Такие неполноценные антигены называются гаптенами или полугаптенами.

Неполноценные антигены обладают только од­ним свойством антигена: они способны специфически взаимодействовать с теми антителами, в индукции синтеза которых они участвовали (после присоединения к белку и превращения в полноценные антигены).

Если взаимодействие неполноценного антигена с антителом сопровождается обычными иммунологическими реакциями, его называют гаптеном. Если неполно­ценный антиген имеет очень небольшую молекулярную массу и его взаимодействие с антителами не сопровождается обычными видимыми реакциями, его называют полугаптеном. О присутствии полугаптена в этом случае судят по тому признаку, что антитела, будучи связаны с полугаптеном, уже не проявляют себя в обычной реак­ции с полноценным антигеном (задерживающая реакция Ландштейнера).

7. Антигенное строение микробной клетки. Основные группы антигенов. Химическая природа антигенной специфичности. Значение изучения антигенов в серологической классификации микроорганизмов.

Антигенное строение микробной клетки. Обладая слож­ным химическим строением, бактериальная клетка представляет собой целый ком­плекс антигенов. Антигенными свойствами обладают жгутики, капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, рибосомы и другие компоненты цитоплаз­мы, а также различные продукты белковой природы, выделяемые бактериями во внешнюю среду, в том числе токсины и ферменты. В связи с этим различают следу­ющие основные виды микробных антигенов: соматические, или О - антигены; жгути­ковые, или Н-антигены; поверхностные, или капсульные К-антигены.

Для медицинской микробиологии наибольший интерес представляют антиген­ные свойства бактерий, токсинов и вирусов. Результаты их изучения используются в практике получения высокоэффективных иммуногенных препаратов, а также для совершенствования методов идентификации возбудителей болезней.

8. Антигенное строение микробной клетки. Н-, О- и К-антигены, токсины и ферменты бактерий как антигены. Перекрестнореагирующие антигены. Принципы определения антигенного состава бактерий, дифференциация общих (групповых) типоспецифических антигенов.

Антигенное строение микробной клетки. Обладая слож­ным химическим строением, бактериальная клетка представляет собой целый ком­плекс антигенов. Антигенными свойствами обладают жгутики, капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, рибосомы и другие компоненты цитоплаз­мы, а также различные продукты белковой природы, выделяемые бактериями во внешнюю среду, в том числе токсины и ферменты. В связи с этим различают следу­ющие основные виды микробных антигенов: соматические, или О - антигены; жгути­ковые, или Н-антигены; поверхностные, или капсульные К-антигены.

Видовая специфичность — антигенные особенности, присущие представите­лям данного вида. Отпечаток видовой специфичности имеют многие макромолекулы данного организма. Определение видовых антигенов может быть использовано для дифференциации особей одного вида от другого.

Групповая специфичность — особенности антигенного строения, свойствен­ные определенной группе особей внутри данного вида организмов. Групповые анти­гены, позволяющие различать отдельных особей или группы особей внутри одного вида, называются изоантигенами.

Гетероспецифичность — антигенная специфичность, обусловленная наличием общих для представителей разных видов антигенов. Гетероантигены обусловливают перекрестные иммунологические реакции.

Типоспецифичность — особенность антигенного строения, которая обусловливает различия среди особей одной группы сходных организмов данного вида и позволяет выделить среди них серотипы, или сероварианты (серова- ры). Выявление сероваров дает возможность осуществлять очень тонкую дифферен­циацию внутри вида микроорганизмов.

Большинство современных классификаций патогенных микроорганизмов по­строены с учетом этих типов антигенной специфичности.

9. Иммунные сыворотки, их назначение, способы получения. Приготовление диагностических агглютинирующих сывороток и их практическое применение.

--В диагностике инфекционных болезней широко применя­ются иммунные реакции при идентификации возбудителя: при установлении родовой, видовой и типовой принадлежности микроба (вируса). Для постановки таких реакций необходимы специфические диагностические сыворотки, которые в зависи­мости от содержания соответствующих антител называются агглютинирующие, преципитирующие, гемо­литические, противовирусные.

--Иммунные сыворотки получают путем гипе­риммунизации животных (ло­шади) специфическим антигеном (анатоксином, бактериальными или вирусными культурами и их антигенами) с пос­ледующим, в период максимального антителообразования, выделением из крови иммунной сыворотки. Иммунные сы­воротки, полученные от животных, называют гетерогенными, так как они содержат чужерод­ные для человека сывороточные белки.

Для получения гомологичных нечужеродных иммунных сывороток используют сы­воротки переболевших людей (коревая, оспенная сыворотки) или специ­ально иммунизированных людей-доноров (противостолбнячная, противоботулиническая), содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакци­нации или перенесенного заболевания.

Нативные иммунные сыворотки содержат ненужные белки (альбумин), из этих сывороток выделяют и подвергают очистке специфические белки- иммуноглобулины. Методы очистки: осаждение спиртом, ацетоном на холоде, обработка ферментами.

Агглютинирующие сыворотки. Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией Кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител. Титром агглютини­рующей сыворотки называется то макси­мальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствую­щим микроорганизмом.

Агглютинирующие сыворотки применяются при идентифи­кации микроба в развернутой реакции агглютинации.

Недостатком таких сывороток является то, что они способ­ны давать групповые реакции агглютинации, так как они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены в пределах семейства, группы и рода.

Поэтому в настоящее время большинство агглютинирую­щих сывороток выпускаются адсорбированиими, монорецепторными и адсорбированными поливалентными, содер­жащими только типовые или видовые антитела и соответст­вующими или определенному типу или виду микроорганизма. Эти сыворотки не подлежат разведению.

10. Структура молекулы антитела. Константные и вариабельные участки легких и тяжелых полипептидных цепей, определяемые ими свойства антител. Классы и типы иммуноглобулинов.

Антитела являются уникальными сывороточными белками — глобулинами.

Совокупность сывороточ­ных белков, обладающих свойствами антител, называют иммуноглобулинами и обозначают символом Ig.

Основная структурная единица молекулы иммуноглобулина состоит из двух идентичных полипептидных L-цепей и двух идентичных Н-цепей. Эти четыре цепи ковалентно связаны дисульфидными связями.

Существуют легкие цепи двух ти­пов - каппа (х) и - лямбда (л).

Идентифи­цировано пять классов тяжелых цепей, их обозначают греческими буквами: альфа (а), гамма (у), эпсилон (е), мю (ц) и дельта (8). Соответственно обозначению тяже­лой цепи обозначается и класс молекул иммуноглобулинов.

Для выяснения природы специфичности антител большое значение имело изуче­ние аминокислотной последовательности L- и Н-цепей. Все легкие цепи состоят из двух почти равных областей, по 110—112 аминокислотных остатков каждая. Первые 110 ( из 214—220) аминокислотных остатков очень изменчивы, т. е. со­ставляют вариабельную (V) область, а остальные 110 остатков у данного вида всегда постоянны, составляя константную (С) область L-цепи. Тяжелая цепь также состоит из вариабельной области (V_н), включающей около 110 аминокислотных остатков, и константной части (С_н).

Существует пять различных классов иммуногло­булинов: IgG, IgМ, IgА, IgЕ, IgD Они различаются по молекулярной массе, содержа­нию углеводов, составу полипептидных цепей, коэффициентам седиментации и дру­гим характеристикам.

11. Антитоксины, их свойства, механизм действия. Значение антитоксинов в формировании иммунитета. Получение и титрование антитоксических сывороток, применение в медицинской практике.

Экзотоксины являются сильными антигенами, а некоторые — даже суперантигенами. Они индуцируют образование в организме антител, т. е. антитоксинов, которые нейтрализуют их действие. При обра­ботке формалином экзотоксины обезвреживаются и превращаются в анатоксины. Анатоксины лишены токсических свойств, но сохраняют свою способность индуциро­вать синтез антитоксинов, поэтому широко используются для создания искусственно­го иммунитета против дифтерии, столбняка, ботулизма и других заболеваний.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Ме­ханизм. Способы постановки, применение.

В основе этой реакции лежит способность специфической ан­титоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувст­вительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.

Реакцию нейтрализации проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микро­организмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализу­ющем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о спе­цифичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

Для прове­дения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свин­кам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследу­емого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сыво­роткой, животные опытной группы останутся живыми. Конт­рольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.

12. Иммунитет. Выработка антител по типу первичного и вторичного иммунного ответа. Образование клеток иммунологической памяти.

Иммунитет – это способ защиты организма от генетически чужеродных веществ – антигенов экзогенного и эндогенного происхождения, направленный на поддержание и сохранение гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма, биологической (антигенной) индивидуальности каждого организма и вида в целом.

Выработка антител по первичному и вторичному иммунному ответу.

Различают два варианта выдачи иммунного ответа в форме биосинтеза антител: первичный ответ — после первой встречи организма с данным антигеном, и вторич­ный ответ — при повторном контакте его с одним и тем же антигеном спустя 2—3 не­дели.

-Первичный иммунный ответ. 1) Биосинтез антител начинается не сразу после контакта с антигеном, а после некоторого латентного периода, продолжающегося 3—5 дней. В течение этого периода происходит процесс распознавания антигена и формирования клеток, которые способны синтезировать антитела к нему; 2) ско­рость синтеза антител относительно невелика; 3) титры синтезируемых антител не достигают максимальных значений; 4) первыми синтезируются антитела, относя­щиеся к иммуноглобулинам класса IgМ, затем IgG. Позже всех появляются, да и то не во всех случаях, IgА и IgЕ.

-Вторичный иммунный ответ.

1) Латентный период очень непродолжитель­ный, в пределах нескольких часов;

2) кривая, характеризующая скорость накопления антител, идет значительно круче вверх, чем при первичном ответе, и имеет логариф­мический характер;

3) титры антител достигают максимальных значений;

4) синте­зируются сразу антитела, относящиеся к классу IgG.

Вторичный иммунный ответ обусловлен формированием клеток иммунной памяти.

Иммунная память на клеточном уровне — это результат генерации особых антиген- специфических популяций Т- и В-клеток памяти. Она проявляется как в отношении выработки антител, так и в отношении других форм иммунного ответа и может сохраняться долгое время.

Клетки памяти представляют собой ту часть Т- и В-антигенстимулированных лимфоцитов, которые после 2—3 делений переходят в покоящееся состояние и дли­тельное время рециркулируют в организме.

13. Современные теории, объясняющие происхождение и специфичность антител. Клонально-селективная теория и ее основные предпосылки. Особенности генетического контроля биосинтеза антител.

Антитела являются уникальными сывороточными белками — глобулинами, ко­торые вырабатываются в ответ на поступление в организм антигена и способны с ним специфически взаимодействовать. Совокупность сывороточ­ных белков, обладающих свойствами антител, называют иммуноглобулинами и обозначают символом Ig

Уникальность антител заключается в том, что они способны взаимодействовать только с тем антигеном, который индуцировал их образование.

Антите­ла — это белки, а синтез каждого белка запрограммирован соответствующим геном.

Схе­матически полный ген L-цепи иммуноглобулинов: L (область, коди рующая лидерный пептид, необходимый для секреции иммуноглобулинов из клетки) — интрон — V-ген — интрон -J-ген — интрон — С-ген.

Схе­матически полный ген Н-цепи иммуноглобулинов: L-ген — интрон — V-ген — интрон — D-ген — интрон — J-ген — интрон — С-ген.

Точки объединения зародышевых генов строго не фиксированы. Это увеличива­ет количество возможных вариантов полипептидных цепей, а в том случае, когда они участвуют в формировании активных центров, то и их разнообразия. Кроме то­го, в период созревания В-лимфоцитов в V-генах происходят точечные соматичес­кие мутации, которые окончательно подгоняют структуру активного центра антите­ла к структуре детерминанта антигена. Считается, что общее количество вариантов антител возрастает за счет неточности сплайсинга и соматических мутаций еще в 100 раз и составляет около 2 млрд:

Таким образом, приобретенный иммунитет может быть обеспечен к любому воз­будителю, к любому возможному чужеродному антигену. Решающий вклад в обеспе­чение многообразия иммуноглобулинов (специфичности антител) вносят следую­щие механизмы:

1. наличие множества зародышевых генов иммуноглобулинов;

2. внутригенные рекомбинации, обусловленные экзон-интронной структурой V-, D-,J-, С-генов;

3. ассоциация различных L-цепей с различными Н-цепями;

4. неточность сплайсинга;

соматические мутации V-генов в зрелых В-лимфоцитах.

14. Центральные и периферические органы иммунитета. Основные формы иммунного ответа. Роль антител в формировании иммунитета. Полные и неполные антитела методы их обнаружения.

-Центральные органы иммунитета. К ним относятся костный мозг, тимус (вилочковая железа), сумка Фабрициуса у птиц, печень у млекопитающих.

-Периферические отделы иммунной системы. К ним относятся: селезенка, лимфатические узлы, лимфоидные ткани желудоч­но-кишечного тракта (пейеровы бляшки и солитарные фолликулы), а также кровь и лимфа, в которые поступают и непрерывно в них циркулируют все иммунокомпетентные клетки. В селезенке содержится больше всего плазматических клеток, воз­никающих в результате дифференцировки из В-лимфоцитов и являющихся основ­ными продуцентами антител.

-Формы иммунного ответа: биосинтез антител, образование клеток иммунной памяти, реакция ги­перчувствительности немедленного типа, реакция гиперчувствительности замед­ленного типа (в том числе трансплантационный иммунитет), иммунологическая то­лерантность, идиотип-антиидиотипические отношения.

Благодаря своей способности специфически взаимодействовать с бактериальны­ми клетками и продуктами их жизнедеятельности, в том числе с токсинами и фер­ментами, а также с другими микроорганизмами, антитела играют важную роль в формировании приобретенного постинфекционного, поствакцинального и пассив­ного иммунитета. Эта их роль заключается в том, что связываясь с токсинами, они нейтрализуют их действие и обеспечивают формирование антитоксического имму­нитета. Связываясь с вирусами, особенно блокируя рецепторы, с помощью которых они адсорбируются на клетках, антитела создают иммунитет против вирусов. Обра­зование комплекса антитело + антиген запускает классический путь активации си­стемы комплемента со всеми его эффекторными последствиями (лизис бактерий, опсонизация, формирование очага воспаления, стимуляция системы макрофагов). Антитела, взаимодействуя с бактериями, опсонизируют их, т. е. делают их фагоци­тоз более эффективным. В результате взаимодействия антител с растворимыми ан­тигенами, выделяющимися в кровь, образуются так называемые циркулирующие иммунные комплексы, с помощью которых антигены выводятся из организма, в ос­новном, желчью и мочой.

Cуще­ствует два типа антигенов — полноценные и неполноценные.

-Полноценные антигены обладают обеими функциями антигена: способностью индуцировать образование антител и специфически с ними взаимодействовать.

-Неполноценные антигены сами по себе способностью индуцировать образование антител не обладают, они приоб­ретают это свойство только после соединения с белками или другими полноценными антигенами. Такие неполноценные антигены называются гаптенами или полугаптенами.

Неполноценные антигены обладают только од­ним свойством антигена: они способны специфически взаимодействовать с теми антителами, в индукции синтеза которых они участвовали (после присоединения к белку и превращения в полноценные антигены).

Если взаимодействие неполноценного антигена с антителом сопровождается обычными иммунологическими реакциями, его называют гаптеном. Если неполно­ценный антиген имеет очень небольшую молекулярную массу и его взаимодействие с антителами не сопровождается обычными видимыми реакциями, его называют полугаптеном. О присутствии полугаптена в этом случае судят по тому признаку, что антитела, будучи связаны с полугаптеном, уже не проявляют себя в обычной реак­ции с полноценным антигеном (задерживающая реакция Ландштейнера).

15. Роль тимуса в иммунитете. Механизм дифференциации стволовых клеток в тимусе в иммунокомпетентные лимфоциты. Система Т-лимфоцитов: Т-киллеры, помощники, Т-супрессоры, Т-контрсупрессоры, их функции.

Клетки, являющиеся предшественниками Т-лимфоцитов, поступают из кровотока в тимус, где и происходит их превращение в иммунокомпетентные Т-лимфоциты под влиянием гуморальных факторов, секретируемых эпителиальными клетками тимуса; затем они покидают его и циркулируют по лимфатической и кровеносной системам, а также расселяются по лимфоидным образованиям организма.

Установлено, что для приобретения иммунокомпетентности клетки необязатель­но должны вступать в непосредственный контакт с тканью тимуса.

Решающая роль в дифференцировке предшественников Т-лим­фоцитов в иммунокомпетентные клетки принадлежит гуморальным факторам, об­разуемым тимусом.

Гуморальные факторы тимуса делят на продукты лимфоидных и продукты нелимфоидных (эпителиальных) клеток.

По характеру действия на Т-клетки гуморальные факторы тимуса делят на фак­торы активации, дифференцировки и размножения. Помимо этого, к числу важней­ших свойств пептидов тимуса относится их способность активировать продукцию лимфокинов; некоторые тимозины, а также сывороточный тимусный фактор усили­вают продукцию Т-клетками интерлейкина-2.

Тимус играет важнейшую роль не только в функционировании иммунной систе­мы и регуляции иммунного гомеостаза, но и опосредует взаимодействие иммунной системы с другими важнейшими системами организма.

По морфологическим свойствам Т- и В-лимфоциты не отличаются друг от друга. Однако они существенным образом различаются по вкладу в реакции иммунитета, по многим другим свойствам, в том числе структуре и функции рецепторов и по ан­тигенной специфичности.

Самый ответственный момент в процессе иммунного ответа — это распознавание химического маркера, свойственного «чужому» агенту и отличающегося от «своего». Эту роль выполняют макрофаги, антитела, Т- и В-лимфоциты. Антитела распознают антиген с помощью своих активных центров, а макрофаги, Т- и В-лимфоциты — благодаря имеющимся на их мембранах особым рецепторам.

Т-лимфоциты по своим функциям разделены на три суб­класса:

-Т-хелперы, или Т-помощники;

-Т-киллеры, или Т-цитотоксические лимфоциты;

-Т-супрессоры.

Т-хелперы необходимы для превращения В-лимфоцитов в антителообразующие клетки и клетки памяти. Т-киллеры разрушают клетки трансплантата, опухолевые клетки и клетки, инфицированные вирусными, бактериальными и другими антиге­нами. Т-супрессоры подавляют функции определенных эффекторных Т- и В-клеток и обеспечивают иммунологическую толерантность.

16. Происхождение и пути дифференцировки клеток-эффекторов иммунной системы. Лимфокины, их роль в иммунитете.

Не все индуцированные антигеном В-лимфоциты подвергаются дифференцировке до конца. Часть из них после нескольких циклов деления перестает размножать­ся и образует субклон клеток памяти (из одной В-клетки образуется около 1000 кле­ток памяти, таким же образом образуются клетки памяти и из Т-лимфоцитов). Клетки памяти определяют продолжительность приобретенного иммунитета. При повторном контакте с данным антигеном они быстро превращаются в клетки-эф­фекторы. При этом В-клетки памяти обеспечивают синтез антител в более короткие сроки, в большем количестве и с более высоким сродством антител другого класса иммуноглобулинов — IgG вместо IgМ.

Таким образом, наиболее важными событиями дифференцировки В-лимфоцитов являются: 1) сборка гена иммуноглобулина из его фрагментов, содержащихся в ДНК эмбриональных клеток; 2) формирование пула клеток памяти; 3) возникновение но­вых вариантов генов в результате дополнительных класс-переключающих реком­бинаций; 4) вспышка соматических мутаций на строго определенной стадии диффе­ренцировки. В результате этих событий происходит образование множества генети­чески стабильных клонов антителообразующих клеток (вероятно, не менее чем 10⁸).

Происхождение и дифференцировка Т- и В-лимфоцитов и макро­фагов из исходных стволовых клеток.

В соответствии с этой схемой, исходная костно-мозговая клетка (НSС) генериру­ет два типа предшественников: лимфоидную стволовую клетку (LSС), от которой происходят клетки-предшественники Т-лимфоцитов (РТС), клетки-предшественни­ки В-лимфоцитов (РВС); и клетку, являющуюся предшественником клеток красной крови, от которой, в свою очередь, происходит предшественник лейкоцитов (СFUс) и берет начало система мононуклеарных макрофагов. Предшественники Т-лимфоцитов под влиянием тимуса превращаются в Т-лимфоциты и их субклассы.

В целом система В-лимфоцитов обеспечивает синтез антител, отвечает за имму­нитет против большинства бактериальных и вирусных инфекций, анафилаксию и другие реакции гиперчувствительности немедленного типа, некоторые аутоим­мунные болезни, за формирование клеток иммунной памяти и иммунологическую толерантность.

Система Т-лимфоцитов играет регуляторную роль по отношению к В лимфо­цитам, отвечает за все реакции гиперчувствительности замедленного типа, имму­нитет против вирусных и некоторых бактериальных инфекций (туберкулез, бру­целлез, туляремия и др.), осуществляет иммунологический надзор, отвечает за противоопухолевый иммунитет, иммунологическую толерантность, некоторые виды иммунопатологии.

Вместе с тем Т- и В-клетки являются двумя частями единой иммунной системы организма. Поэтому деление иммунитета на гуморальный и клеточный носит весь­ма условный характер, так как антитела синтезируются В-клетками. а Т-лимфоциты и другие клетки осуществляют свою иммунокомпетентность через синтезируемые ими гуморальные факторы (цитокины, лимфокины, интерлейкины и др.).

Координированное взаимодействие макрофагов, Т- и В-лимфоцитов при встрече с антигеном обеспечивает выдачу адекватного иммунного ответа.

17. Определение понятия иммунитет. Феномен бласттрансформации как пример распознавания генетически отличающихся клеток лимфоцитами и превращения их клетки-эффекторы.

Иммунитет – это способ защиты организма от генетически чужеродных веществ – антигенов экзогенного и эндогенного происхождения, направленный на поддержание и сохранение гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма, биологической (антигенной) индивидуальности каждого организма и вида в целом.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТ). В основе этой реакции лежит способность нормальных лимфоцитов перифери­ческой крови вступать в митоз и превращаться в бластные формы при культивировании их in vitro под действием специфических фак­торов — аллергенов и неспецифических стимуляторов митогенеза — митогенов (фитогемагглютинин, конканавалин А, липополисахариды и другие вещества).

18. Система В-лимфоцитов, их происхождение, основные свойства, природа специфических рецепторов. Превращение В-лимфоцитов в антителообразующие клетки.

B-лимфоциты – преимущественно эффекторные иммунокомпетентные клетки. Зрелые В-лимфоциты и их потомки – плазматические клетки являются антителопродуцентами. Их основными продуктами являются иммуноглобулины. В-лимфоциты участвуют в формировании гуморального иммунитета, В-клеточной иммунологической памяти и гиперчувствительности немедленного типа.

В-лимфоциты помимо антигенов Lу, общих с Т-лимфоцитами, имеют свойственные только им антигены Lyb. В-лимфоциты подраз­деляют на Lyb5+, т. е. имеющие этот антиген, и Lyb5- .

В-лимфоциты Lyb5- и Lyb5+ отличаются по условиям своей активации. В связи с этим В-лимфоциты подразделяют на три основные субпопуляции:

1. Клетки В-1а (СД5+), первыми появляющиеся в онтогенезе.

2. Клетки В-1b (СД5-). Клетки этих двух субпопуляций продуцируют НИГ.

3.Клетки В-2, которые впоследствии дифференцируются в АОК и играют веду­щую роль в формировании приобретенного специфического иммунитета.

1. Помимо, существуют также В-супрессоры и В-киллеры. В-супрессоры выполняют такую же роль, как и Т-супрессоры. В-киллеры взаимодействуют с Fс-фрагментами IgG, фиксированных на клетках трансплантата, и разрушают их.

В ходе своего созревания (от эмбриональной клетки до рождения), а также по­сле рождения В-лимфоциты подвергаются дифференцировке, биологический смысл которой состоит в создании клона клеток, синтезирующих и секретирующих антите­ла, специфически взаимодействующие с данным антигеном.

Процесс созревания В-лимфоцитов включает в себя две стадии:

1. 1. Антигеннезависимую, которая происходит в эмбриональном периоде.

2. 2. Антигензависимую, которая происходит после рождения и наступает только после встречи с соответствующим антигеном.

19. И. И. Мечников и его учение о невосприимчивости к инфекционным болезням Клеточная теория иммунитета Мечникова в свете современных данных. Роль макрофагов в иммунном ответе. Механизм кооперативного взаимодействия Т-лимфоцитов и макрофагов в распознавании антигена.

И. И. Мечников, изучая воспалительные процессы у различных групп животных, обратил внимание на то, что вводимое в их организм инородное тело всегда окружа­лось подвижными амебовидными клетками мезодермы, способными его заглаты­вать. Такие клетки являются непременными участниками воспалительных процес­сов как у животных, имеющих кровеносную систему, так и у организмов, лишенных ее. Процесс поглощения чужеродных элементов этими клетками И. И. Мечников на­звал фагоцитозом, а сами клетки — фагоцитами. Изучив подробно фагоцитоз, И. И. Мечников показал, что у простейших он служит целям питания, а у многоклеточных — целям их защиты.

И. И. Мечников выступил с докладом «О целебных свойствах организма», в котором сообщил, что «подобные клетки (фа­гоциты) должны служить в организме для противодействия вредным деятелям». В последующем И. И. Мечников и его сотрудники обстоятельно изучили фагоцитар­ную реакцию у млекопитающих и, наконец, у человека. Так была создана фагоцитар­ная теория иммунитета, и целебные силы организма впервые были связаны с со­зданной самой природой для этих целей системой особых клеток — фагоцитов.

За короткий срок учение о невосприимчивости к инфекционным болезням до­стигло расцвета. В это время И. И. Мечников дал следующее определение понятия иммунитета. «Под невосприимчивостью к заразным болезням надо понимать общую систему явлений, благодаря которым организм может выдерживать нападение болезнетворных микробов. В настоящее время невозможно дать более точное определение, так что бесполезно настаивать на этом».

Макрофагам принадлежит исключительно важная роль в обеспечении защитных реакций. Основные Функции, посредством которых они выполняют эту роль, могут быть разделены на четыре типа:

1) Хемотаксис.

2) Фагоцитоз.

3) Секреция биологически активных соединений.

4) Переработка антигена (процессинг) и представ­ление его с участием белков МНС класса II иммунокомпетентным клеткам, принимающим участие в форми­ровании иммунного ответа (кратко — процессинг и представление антигена).

Форми­рование приобретенного специфического иммунитета происходит благодаря коопера­тивному взаимодействию макрофагов (и других антигенпредставляющих клеток), В- и Т-лимфоцитов и при активном участии всех остальных иммунных систем.

Самый ответственный момент в процессе иммунного ответа — это распознавание химического маркера, свойственного «чужому» агенту и отличающегося от «своего». Эту роль выполняют макрофаги, антитела, Т- и В-лимфоциты. Антитела распознают антиген с помощью своих активных центров, а макрофаги, Т- и В-лимфоциты — благодаря имеющимся на их мембранах особым рецепторам.

Т-хелперы необходимы для превращения В-лимфоцитов в антителообразующие клетки и клетки памяти. Т-киллеры разрушают клетки трансплантата, опухолевые клетки и клетки, инфицированные вирусными, бактериальными и другими антиге­нами. Т-супрессоры подавляют функции определенных эффекторных Т- и В-клеток и обеспечивают иммунологическую толерантность.

20. Роль макрофагов в иммунитете.

Макрофагам принадлежит исключительно важная роль в обеспечении защитных реакций. Основные Функции, посредством которых они выполняют эту роль, могут быть разделены на четыре типа:

1) Хемотаксис.

2) Фагоцитоз.

3) Секреция биологически активных соединений.

4) Переработка антигена (процессинг) и представ­ление его с участием белков МНС класса II иммунокомпетентным клеткам, принимающим участие в форми­ровании иммунного ответа (кратко — процессинг и представление антигена).

21. Роль фагоцитоза в защитных реакциях организма. Механизм и фазы фагоцитарно­го процесса. Завершенный и незавершенный фагоцитоз. Мононуклеарная фагоцитарная система. Опсонины.

Фагоцитоз — это уничтожение чужеродного объекта и представление антигена для запуска цепи иммунных реакций, приводящих к формированию иммунитета. Функция фагоцитоза является центральной, посколь­ку она запускает секрецию обширного круга биологически активных веществ широ­кого спектра действия, в том числе медиаторов иммунного ответа, реакции воспале­ния, а также обеспечивает процессинг и представление антигена.

Процесс фагоцитоза складывается из следующих этапов:

1) продвижение фагоцита к объекту фагоцитоза, например к бактериальной клетке;

2) прилипание бактерии к фагоциту;

3) поглощение бактериальной клетки;

4) исход фагоцитоза. Энергия, необхо­димая для поглощения макрофагами чужеродных частиц, обеспечивается благодаря гликолизу. Агенты, угнетающие гликолиз, резко подавляют фагоцитоз.

Возможны три исхода фагоцитоза:

1) полное внутриклеточное переваривание микробных кле­ток — завершенный фагоцитоз;

2) приживление и активное размножение бактерий внутри фагоцита — незавершенный фагоцитоз;

3) выталкивание микробов из фагоцитов обратно в окружающую среду. Незавершенный фагоцитоз часто на­блюдается при вяло и длительно протекающих инфекционных болезнях и служит одной из причин хрониосепсиса.

Одним из мощных факторов резистентности является фагоцитоз.И. И. Мечников установил, что фагоцитарными свойствами обладают зернистые лейкоциты крови и лимфы, главным образом полиморфно-ядерные нейтрофилы (микрофаги), а также моноциты и различные клетки ретикулоэндотелиальной системы, которые он назвал макрофагами. В настоящее время под макрофагами понимают клетки, которые обла­дают высокой фагоцитарной активностью. Они различаются по форме и размерам, в зависимости от тканей, где они обнаруживаются. По классификации ВОЗ (1972), все макрофаги объединены в систему мононуклеарных фагоцитов.

22. Реакция гиперчувствительности немедленного типа. Анафилаксия, ее обусловленность веществами антигенной природы. Условия, определяющие возможность развития анафилаксии и ее механизм. Способы предупреждения анафилактической реакции.

К реакциям гиперчувствительности немедленного типа (ГЧН) относятся: сыво­роточная анафилаксия, лекарственная анафилаксия, сывороточная болезнь, сен­ная лихорадка, бронхиальная астма, крапивница и другие аллергические реакции, в том числе к таким аллергенам, как пыльца некоторых растений, красители, шерсть и т. п. В их основе лежат общие механизмы, которые лучше всего изучены при анафилаксии.

Реакции анафилаксии, как и другие реакции гиперчувствительности немедленно­го типа, являются иммунологически специфичными и проявляются в отношении то­го антигена, к которому организм сенсибилизирован. Для возникновения состояния сенсибилизации достаточно введения очень малых доз антигена (аллергена). Состояние повышенной чувствительности развива­ется через 7—14 дней после введения антигена и сохраняется месяцами и годами. Для его выявления вводят внутривенно вторую, разрешающую дозу антигена. Если разрешающую дозу ввести не внутривенно, а внутрикожно, то развивается местная анафилаксия (феномен Артюса). Она характеризуется появлением через 30—60 мин на месте введения отека и развитием гиперемии. В последующем воспалительный очаг уплотняется, подвергается некрозу и рубцеванию.

Реакция анафилаксии характеризуется следующими особенностями: иммуноло­гической специфичностью, немедленностью проявления (анафилактический шок развивается через несколько минут после введения разрешающей дозы) и опосредо- ванностью антителами.

В развитии анафилаксии можно выделить следующие три стадии: 1) иммуноло­гическую, 2) патохимическую и 3) патофизиологическую. Иммунологическая стадия, которая определяет специфичность анафилаксии, характеризуется взаимо­действием антигена с антителом, фиксированным на клетках сенсибилизированного организма. Для патохимической стадии характерна активация протеолитических ферментов, в результате действия которых из клеток высвобождаются биологичес­ки активные вещества. В настоящее время известно более 30 таких веществ, участву­ющих в механизме развития анафилаксии, однако основная роль принадлежит гистамину, серотонину, брадикинину и лейкотриенам. Патофизиологическая стадия развивается в результате действия биологически активных веществ на различные системы органов, в особенности на гладкую мускулатуру. Наблюдающееся в резуль­тате такого воздействия сокращение гладких мышц определяет клиническую карти­ну анафилактического шока, у человека страдает сердечно-сосудистая система. К наиболее характерным симптомам анафилактического шока относятся: гипотония, учащение мочеиспуска­ния и дефекации, отек, лейкопения, тромбоцитопения, снижение титра комплемен­та, понижение свертываемости крови и температуры тела.

В развитии кожной реакции, выявляющей гиперчувствительность немедленною типа, преобладающую роль играют полиморфно-ядерные лейкоциты.

--Механизм анафилаксии. Основную роль в механизме анафилаксии и других реакций гиперчувствительно­сти немедленного типа играет процесс взаимодействия с антигеном антител, фикси­рованных на клетках, которые в результате этого взаимодействия высвобождают биологически активные вещества. Клетками, способными высвобождать медиаторы данного типа повышенной чувствительности явля­ются мастоциты и базофилы. Мастоциты находятся в соединительной ткани почти всех органов. В самом общем виде механизм анафилаксии может быть описан следующим об­разом. Введение сенсибилизирующей дозы антигена индуцирует образование специ­фических антител, в том числе относящихся к классу IgЕ. Благодаря своей цитофильности последние фиксируются на поверхности тучных клеток и базофилов. Этот процесс и лежит в основе сенсибилизации организма к данному антигену. Попадая повторно в организм, он распознается антителами, фиксированными на клетках, и быстро вступает во взаимодействие с ними. Следствием этого является активация протеаз клеток, в результате которой высвобождаются медиаторы, опо­средующие патофизиологическую основу анафилактического шока.

Развитие анафилактического шока можно предупредить с помощью различных лекарственных препаратов, например атропина, димедрола, эфирного наркоза, а также других веществ с различным механизмом действия (сапонин, желчно-кислотные соли и т. п.). Вместе с тем установлено, что если животное благополучно пере­несло анафилактический шок, оно утрачивает на некоторое время (2—3 нед.) чув­ствительность к данному антигену. Такое же состояние десенсибилизации может быть достигнуто путем введения сенсибилизированному животному небольших раз­решающих доз специфического антигена. В связи с этим А. М. Безредка предложил для предупреждения сывороточного анафилактического шока перед введением большой дозы сыворотки вводить сначала небольшую ее часть (0,5-1,0 мл) под­кожно или несколько более мелких, но постепенно возрастающих доз внутривенно с интервалом 15—30 мин.

23. Реакции гиперчувствительности замедленного, типа, их отличия от реакций: гиперчувствительности немедленного типа. Основные клетки - эффекторы реакций гиперчувствительности замедленного типа и трансплантационного иммунитета, их специфические рецепторы. Роль лимфокинов.

Этот тип гиперчувствительности возникает при многих инфекционных болезнях, например при туберкулезе, бруцеллезе, дизентерии, токсоплазмозе, некоторых гельминтозах, микозах и т. д., и выявляется с помощью соответствующих кожных реакций, которые служат специфическими диагностическими пробами. Состояние гиперчувствительности замедленного типа могут индуцировать различные лекар­ственные препараты, красители, антисептики и другие аллергены. К аллергенам ор­ганической и неорганической природы, имеющим низкую молекулярную массу, но обладающим способностью соединяться с белками кожи и слизистых оболочек (т. е. являющимся гаптенами), нередко возникает так называемая контактная ал­лергия. Сенсибилизация формируется в результате длительного контакта с такими веществами и проявляется в местных изменениях на коже и слизистых оболочках. Наиболее типичным примером повышенной чувствительности замедленного типа является аллергическая реакция кожи больных туберкулезом людей и животных на туберкулин. К реакциям гиперчувствительности замедленного типа относится также трансплантационный иммунитет.

Гистологическая картина местных проявлений гиперчувствительно­сти замедленного действия отличается от таковой при повышенной чувствительно­сти немедленного типа тем, что в очаге реакции преобладают лимфоциты и моноци­ты.

Главное отличие реакций ГЗТ от реакций ГНТ заключается в том, что они опосредуют­ся не антителами, а сенсибилизированными клетками — Т-лимфоцитами, т. е. лим­фоцитами, которые прошли иммунологическое «обучение» в тимусе. Т-лимфоциты несут на своей поверхности различные специфические рецепторы, с помощью которых распознают самые различные чужеродные вещества, в том числе трансплантационные антигены, и способны с ними взаимодействовать. Все типы реакций гиперчувстви­тельности замедленного действия характеризуются общностью иммунологических механизмов, в которых главными действующими агентами являются лимфоциты и продуцируемые ими гуморальные факторы.

Опосредуемость этих реакций лимфо­цитами подтверждается многими феноменами среди которых в первую очередь можно выделить следующие три:

2. 1)Состояние повышенной чувствительности замедленного типа можно передать от донора другому организму, но только путем введения последнему от сенсибили­зированного организма его лимфоцитов, а не антител.

3. 2) В отличие от пассивного, такой тип иммунного состояния, передаваемого не сывороткой, а лимфоцитами, получил название адоптивного, т. е. присвоенного. Например, если от сенсибилизированного туберкулином животного передать внутривенно или внутрибрюшинно лимфоидные клетки здоровому животному, то оно будет отвечать на введение туберкулина положительными кожными реакциями гиперчувствитель­ности замедленного типа.

4. 3) Реакции гиперчувствительности замедленного типа можно подавить или осла­бить, если перед введением разрешающей дозы аллергена ввести антилимфоцитарную сыворотку.

С реакцией ГЧЗ хорошо коррелирует способность сенсибилизированных Т-лимфоцитов синтезировать различные медиаторы - лимфокины, в том числе фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (ФИМ).

Т-лимфоциты, участвующие в реак­циях гиперчувствительности замедленного типа, обозначают как Тгчз. они имеют обычно фенотип Lyt-1-2+, т. е. обладают специфическими рецепторами, с помощью которых осуществляют свои функции. Таким образом, можно считать окончательно установленным, что реакция ГЧЗ является одной из форм иммунного ответа, опосредуемого сенсибилизированными Т-лимфоцитами (Тгчз) и выявляемого в виде характерного воспаления; в месте введения (обычно в коже) антигена, который индуцировал ее развитие.

24. Трансплантационный иммунитет и его механизм. Феномен инактивации несингенных стволовых клеток и его роль в поддержании генетического гомеостаза.

Под трансплантационным иммунитетом понимают отторжение генетически от­личающегося от хозяина трансплантата. Хотя по отношению к антигенам транс­плантата организм также может вырабатывать антитела, главная роль в механизме трансплантационного иммунитета, как и всех реакций гиперчувствительности за­медленного типа, принадлежит популяции Т-лимфоцитов, которые получили назва­ние Т-цитотоксических лимфоцитов, или Т-киллеров.

Ведущая роль лимфоцитов в реакциях трансплантационного иммунитета подтверждается следующими феноме­нами:

1)Феномен «трансплантат против хозяина». Клетки лимфоидной ткани, переса­женные в генетически отличающийся организм, продолжают вести себя так же, как и в собственном организме, — в соответствии со своей главной функцией они распо­знают клетки нового хозяина как генетически чужеродные, атакуют и разрушают их.

2)Трансфер-реакция (местное проявление реакции «трансплантат против хозяи­на»), Суть этого явления в том, что если организму, который был предварительно сенсибилизирован трансплантатом аллогенного донора, ввести внутрикожно лим­фоциты того же донора, через 24—48 ч на месте введения наблюдается кожная реак­ция, аналогичная туберкулиновой. Подобная реакция может быть воспроизведена, хотя и не в столь резкой форме, при внутрикожном введении и неиммунных лимфо­цитов, но обязательно от генетически чужеродного донора.

В основе этой реакции лежит все то же свойство Т-лимфоцитов — способность распознавать чужеродные антигены и реагировать на них. Из экстрактов сенсибили­зированных Т-лимфоцитов выделен фактор переноса гиперчувствительности замед­ленного типа — трансфер-фактор.

Цитотоксические Т-лимфоциты относятся к субпопуляции, несущей специфиче­ские рецепторы Lyt-2 и Lyt-3.

25. Инфекционная аллергия. Аллергическая проба в диагностике инфекционных бо­лезней. Отличие реакций гиперчувствительности замедленного типа от реакций гиперчувствительности немедленного типа.

Аллергические пробы - биологические реакции для диагностики ряда заболеваний, основанные на повышенной чувствительности организма, вызванной аллергеном.

При многих инфекционных заболеваниях за счет активации кле­точного иммунитета развивается повышенная чувствительность организма к возбудителям и продуктам их жизнедеятельности. На этом основаны аллергические пробы, используемые для диагно­стики бактериальных, вирусных, протозойных инфекций, мико­зов и гельминтозов. Аллергические пробы обладают специфично­стью, но нередко они бывают положительными у переболевших и привитых.

Все аллергические пробы подразделяют на две группы — про­бы in vivo и in vitro.

-К первой группе (in vivo) относятся кожные пробы, осуществ­ляемые непосредственно на пациенте и выявляющие аллергию немедленного (через 20 мин) и замедленного (через 24 — 48 ч) типов.

-Аллергические пробы in vitro основаны на выявлении сенсиби­лизации вне организма больного. Их применяют тогда, когда по тем или иным причинам нельзя произвести кожные пробы, либо в тех случаях, когда кожные реакции дают неясные результаты.

Для проведения аллергических проб используют аллергены — диагностические препараты, предназначенные для выявления специфической сенсибилизации организма. Инфекционные ал­лергены, используемые в диагностике инфекционных заболева­ний, представляют собой очищенные фильтраты бульонных куль­тур, реже взвеси убитых микроорганизмов или АГ, выделенные из них.

Ос­новные отличия гиперчувствительности замедленного типа от повышенной чув­ствительности немедленного типа следующие.

Во-первых, местные и общие реакции, выявляющие гиперчувствительность за­медленного типа, развиваются спустя значительно больший срок после введения антигена, чем в случае гиперчувствительности немедленного типа. В частности, кож­ные реакции в этом случае появляются через 6—8 ч и достигают максимального раз­вития через 1—2 суток. Интенсивность ГЧЗ определяют по диаметру уплотненного участка ткани на поверхности кожи, лишенной волос. Таким образом, для реакции повышенной чувствительности замедленного типа характерно отсутствие эффекта немедленности.

Во-вторых, гистологическая картина местных проявлений гиперчувствительно­сти замедленного действия отличается от таковой при повышенной чувствительно­сти немедленного типа тем, что в очаге реакции преобладают лимфоциты и моноци­ты. В развитии кожной реакции, выявляющей гиперчувствительность немедленною типа, преобладающую роль играют полиморфно-ядерные лейкоциты.

В-третьих, гиперчувствительность замедленного типа не может быть передана пассивно от сенсибилизированного организма с помощью его сыворотки интактному (несенсибилизированному) организму, т. е. этот тип повышенной чувствительно­сти не связан с антителами.

Главное отличие реакций гиперчувствительности замедленного типа от реакций гиперчувствительности немедленного типа заключается в том, что они опосредуют­ся не антителами, а сенсибилизированными клетками — Т-лимфоцитами, т. е. лим­фоцитами, которые прошли иммунологическое «обучение» в тимусе.

26. Иммунологическая толерантность, ее обусловленность веществами антигенной природы и иммунологическая специфичность. Критерии толерантности. Т- и В- супрессоры и их роль в формировании толерантности. Способы получения иммунологической толерантности у взрослых организмов.

Под иммунологической толерантностью (отсутствием иммунного ответа) пони­мают специфическое подавление иммунного ответа, вызванное предварительным введением антигена. Толерантность может проявляться в подавлении специфичес­кого иммунного ответа, включающего и синтез антител на соответствующий анти­ген, и гиперчувствительность замедленного типа, или же избирательно влияет на синтез антител того или иного класса иммуноглобулинов либо на тип иммунного от­вета.

Толерантность может быть полной либо частичной (существенное снижение иммунного ответа).

Изучение

Они предположили, что в результате воздействия на лимфоидную систему собственных антигенов во время эмбрионального развития, пока еще иммунная си­стема не созрела, у животного формируется специфическая толерантность к антиге­нам собственных тканей. Поэтому, если воздействовать чужеродным антигеном на животное до созревания его иммунной системы, то такой антиген впоследствии бу­дет распознаваться как собственный, и он не станет вызывать иммунного ответа. Следовательно, введение антигена эмбриону не только не вызывает обычных имму­нологических реакций, направленных на удаление этого антигена, а, наоборот, индуцирует развитие к нему толерантности. Состояние иммунологической толерант­ности к различным антигенам возможно получить искусственно, что позволило вы­яснить его основные механизмы.

Для иммунологической толерантности, как одной из форм иммунного ответа, характерны следующие особенности:

Во-первых, развитие этого состояния индуцируется только веществами антиген­ной природы.

Во-вторых, толерантность иммунологически специфична.

В-третьих, искусственно полученная толерантность проявляется в разной степени, и продолжительность ее сохранения сильно варьирует. Это зависит от периода жиз­ни, во время которого индуцируется развитие толерантности, от характера исполь­зуемого для этой цели антигена, его дозы, физических свойств и способа введения, а также от физиологического состояния организма.

Эффективнее всего развитие толерантности удается индуцировать в эмбриональном периоде, хотя ее можно вызвать и у взрослых животных. Однако чем позднее, тем это состояние индуцируется труднее и большей дозы антигена требует. Чем больше доза антигена, тем выше степень толерантности и тем дольше она сохраняется.

Определенные способы введения антигена, не вызывающие иммунного ответа, приводят к развитию толерантности. Её очень легко вызывают микробные полисахариды. Установлено, что уменьшение молекулярной массы антигена при сохранении его специфичности снижает способность вызывать иммунный ответ, но повышает толерантную актив­ность. Для поддержания состояния иммунологической толерантности важно постоянное присутствие антигена. Развитие иммунологической толерантности во многом зависит от физиологичес­кого состояния организма. Любые воздействия, подавляющие иммунный ответ будут способствовать развитию толерантности.

Необходимость создания иммунологической толерантности во взрослом состоя­нии всегда возникает при аллотрансплантации для преодоления трансплантацион­ного иммунитета. В этих случаях прибегают к облучению организма реципиента рентгеновскими лучами или использованию химиопрепаратов, подавляющих био­синтез ДНК и размножение клеток лимфоидной ткани. Такими иммунодепрессивными препаратами являются 6-меркаптопурин, аметоптерин, акрифлавин, циклофосфамид, антилимфоцитарная сыворотка. Очень сильным супрессором иммунной системы является антибиотик циклоспорин А.

27. Методы микробиологической диагностики инфекционных болезней. Серологические реакции. Коагглютинация. Радиоиммунный метод (РИМ). Иммуноферментный метод (ИФМ).

Взаимодействие антигена с антителом проявляется в форме различных иммуно­логических, или серологических реакций. В связи с их вы­сокой чувствительностью и специфичностью они нашли широкое диагностическое применение.

С диагностической целью используют следующие серологические реакции:

1. Реакция агглютинации в ее различных вариантах.

2. Реакция преципитации и ее различные модификации.

3. Реакции иммунофлуоресценции (РИФ) в прямом и непрямом вариантах.

4. Реакции, протекающие с участием комплемента.

5. Реакции, протекающие с участием фагоцитов.

6. Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы.

7. Реакции нейтрализации биологической активности возбудителя или токсинов.

Реакция коагглютинации. Является одним из вариантов пассивной, т. е. опо­средованной клетками-носителями антител, ускоренной реакции агглютинации на стекле. В основу этой реакции положено уникальное свойство золотистого стафило­кокка, имеющего в составе своей клеточной стенки белок А, связываться с Fс-фрагментами и IgМ. При этом активные центры антител остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигенов. На предметное стекло наносят каплю 2 %-ной взвеси стафилококков, сенсибилизированных соот­ветствующими антителами, и добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий. При соответствии антигена антителам через 30—60 с происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков.

Обнаружение антигена с помощью ИФМ и РИМ.

Первый этап — адсорбция специфических антител твердой фазой, в качестве которой обычно используют полистироловые или поливинилхлоридные поверхно­сти лунок пластиковых микротитраторных панелей. Антитела нековалентно связы ваются со стенками лунок, у них сохраняются свободными активные центры, и по­этому они способны специфически реагировать с соответствующим антигеном.

Второй этап — связывание антигена из суспензии исследуемого материала за счет реакции антитело + антиген, происходящей на границе твердая фаза—жидкость. После этого луночки промывают раствором, содержащим слабый неионный детергент, для удаления из системы других, неспецифически связанных с антителами компонентов.

Третий этап - обработка твердой фазы с фиксированными на ней комплексами антитело + антиген специфическими антителами против данного антигена, но мечен­ными либо ферментом, либо изотопом. Такие меченые антитела присоединяются к ан­тигенам, а их избыток удаляется из системы промыванием. Таким образом, в случае присутствия в исследуемом материале искомого антигена на поверхности твердой фа­зы формируется комплекс: антитело + антиген + меченое антитело. Результаты реакции учитывают в зависимости от характера метки. Для иммуноферментного метода антите­ла метят ферментом, чаще всего пероксидазой или щелочной фосфатазой. Субстратом для пероксидазы служит Н₂0₂ в смеси с ортофенилендиамином, используемые в виде раствора в цитратно-фосфатном буфере (рН 5,0). Добавление в опытную луночку рас­твора субстрата приводит к тому, что он подвергается действию пероксидазы, фиксиро­ванной на антителах, образующиеся продукты реакции имеют желтую окраску, интен­сивность которой может быть определена путем фотометрирования.

Радиоиммунный метод (РИМ) предусматривает использование антител, мечен­ных изотопом, поэтому результаты реакции оценивают путем определения радиоак­тивности исследуемых образцов. При положительной реакции уровень радиоактив­ности опытных образцов более чем в 2 раза превышает уровень радиоактивности контрольных, заведомо отрицательных образцов.

Обнаружение специфических антител с помощью ИФМ и РИМ

Для обнаружения антител реакции также ставят в три этапа. Первый этап — адсорбция специфических антигенов на стенках луночек. Обычно планшеты в коммерческих тест-системах уже имеют сенсибилизированные луночки, т. е. на их дне и стенках антигены уже адсорбированы.

Второй этап — добавление в луночки образцов исследуемой сыворотки для обнаружения в ней специфических антител к данному антигену. Если они имеют­ся, то вступают во взаимодействие с антигеном и образуют комплекс антиген + + антитело.

Третий этап — после отмывания луночек в них добавляют специфические анти- глобулиновые антитела (антивидовые, т. е. антитела против человеческих иммуно­глобулинов), но меченные ферментом (ИФМ) либо изотопом (РИМ). Результаты реакции оценивают, как указано выше. В качестве контроля используют образцы заведомо положительные и заведомо отрицательные.

Предложены различные варианты иммуноферментного метода. Большое значе­ние имеет вариант ИФМ, позволяющий осуществлять «захват» антител, относящихся к IgМ. Этот метод позволяет более точно производить серологическую диагностику, так как основан на обнаружении специфических иммуноглобулинов IgМ, которые появляются в первую очередь при встрече с возбудителем.

28. Иммунофлуоресцентный метод (прямой и непрямой) диагностики инфекционных бо­лезней. Сущность метода, его преимущества и недостатки.

Реакция иммунофлуоресценции.

Молекулы иммуноглобулинов способны необратимо связываться (метиться) с некоторыми химическими веществами без потери своей антительной специ­фичности и свойства связываться с антигеном. Для такого мечения можно ис­пользовать красители, флуоресцирующие при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например изотиоционат флуо- ресцеина, дающий зеленовато-желтое окрашивание, или другие флуорохромы. Использование для обнаружения антигенов меченных флуорохромами антител, т. е. реакцию иммунофлуоресценции (РИФ), предложил в 1950 г. А. Куне. С по­мощью РИФ можно быстро обнаруживать даже ничтожные количества антиге­нов, в том числе бактериальных и вирусных, по эффекту флуоресценции ком­плекса антиген + антитело в люминесцентном микроскопе.

Метод иммунофлуоресценции используют в двух вариантах. Один из них полу­чил название прямого метода РИФ, и в этом случае метят антитела, которые не­посредственно участвуют в реакции с исследуемым антигеном. Второй вариант известен под названием непрямого метода РИФ. В этом случае с исследуемым антигеном вначале взаимодействуют специфические к нему антитела, а уже с ни­ми взаимодействуют антивидовые антитела (антитела против иммуноглобули­нов диагностической сыворотки), меченные флуорохромом (рис. 74). Преиму­ществом непрямого метода РИФ является то, что при его использовании отпадает необходимость иметь большой набор различных специфических флуоресцирую­щих антител, так как он основан на использовании антиглобулиновых антител. В качестве последних обычно используют сыворотку козы или барана, иммунизи­рованных сывороткой кролика (коммерческие диагностические иммунные сыворотки чаще всего готовят путем иммунизации кроликов). Непрямой метод иммунофлуо­ресценции применяют не только для ускоренного обнаружения антигенов (воз­будителя), но и для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Напри­мер, для серологической диагностики токсоплазмоза токсоплазмы фиксируют на предметном стекле и обрабатывают сывороткой исследуемого больного. После ее отмывки мазок повторно обрабатывают сывороткой, содержащей меченные флуорохромом антитела против человеческого глобулина. Если в крови больно­го есть антитела, т. е. человек болен, в люминесцентный микроскоп будут видны светящиеся токсоплазмы.

29. Реакция пассивной гемагглютинации, механизм протекания и ее практическое применение.

Классическая реакция агглютинации предусматривает использование корпуску­лярных антигенов. Однако в ней могут участвовать и растворимые антигены. Чтобы это стало возможным, такие антигены адсорбируют на иммунологически инертных частицах. В качестве носителя можно использовать частицы латекса или бентонита, однако в настоящее время наиболее часто применяют эритроциты животных или че­ловека, улучшая их адсорбирующие свойства обработкой растворами танина, фор­малина или бензидина. Эритроциты, адсорбировавшие на себе антиген, называются сенсибилизированными данным антигеном, а иммунная реакция, в которой они уча­ствуют, — реакцией непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА, или РПГА), так как эритроциты участвуют в ней пассивно.

РПГА ставят в специальных полистироловых пластинках с луночками, имею­щими полусферическое дно. При использовании ее для серологической диагности­ки в этих луночках готовят двукратные разведения в физиологическом растворе исследуемой сыворотки и затем добавляют к ней в качестве диагностикума взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Учет результатов проводят через 2 ч инкубации при температуре 37 °С по четырехкрестной системе. При положительной реакции агглютинировавшиеся эритроциты оседают на дно луночки и равномерно покры­вают его в виде перевернутого зонтика. При отрицательной реакции эритроциты тоже оседают, жидкость становится прозрачной, осадок выглядит как маленький диск в центре луночки. Титром сыворотки в РПГА считается последнее ее разведение, которое еще дает ярко выраженную гемагглютинацию без значительных призна­ков наличия диска.

РПГА может применяться также в качестве ускоренного метода бактериологиче­ской диагностики для обнаружения непосредственно в исследуемом материале неиз­вестных бактерий, вирусов, токсинов, например возбудителей чумы, стафилококко­вых энтеротоксинов и др. При таком варианте постановки РПГА в роли известного компонента реакции используют эритроциты, адсорбировавшие антитела известной специфичности — антительный эритроцитарный диагностикум. Если исследуемый материал содержит достаточное количество известного антигена, РПГА будет поло­жительна.

Вариантами использования РПГА являются: реакция нейтрализации антигена (РНАг), реакция нейтрализации антител (РНАт), реакция торможения пассив­ной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используют антигенные и ан­тительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаимно контролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с ан­тигенным диагностикумом и РНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (РНАт) заключается в том, что суспензию, со­держащую искомый антиген, смешивают со специфической иммунной сывороткой, содержащей известные антитела, в соответствующих объемах и инкубируют при температуре 37 °С в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эрит­роцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной темпера­туре. Результаты учитывают через 3—4 ч и окончательно — через 18—24 ч. Если в исследуемом материале имеется антиген, он свяжет антитела (нейтрализует их), и по­этому гемагглютинации не произойдет.

По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации антигена (РНАг). Только в этом случае в исследуемом материале обнаруживают антитела. Специфический ан­тиген, добавленный к такому исследуемому материалу, будет связываться с антите­лами, содержащимися в нем, т. е. произойдет нейтрализация антигена антителами, и поэтому гемагглютинации при добавлении антительного эритроцитарного диа- гностикума не произойдет.

30. Агглютинины и реакция агглютинации. 0- и Н-агглютинация бактерий. Механизм реакции агглютинации. Получение агглютинирующих сывороток. Методика поста­новки и оценки результатов развернутой реакции агглютинации.

Реакция агглютинации

Агглютинация (лат. а^ЫЫпаНо — склеивание) - склеивание (соединение) антигеннесущих корпускулярных частиц (цельные клетки, частицы латекса и др.) молекулами специфических антител в присутствии электролитов, которое закан­чивается образованием видимых невооруженным глазом хлопьев или осадка (аг- глютината). Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевидный осадок, безжгутиковые и бескапсульные — мелкозер­нистый, капсульные — тяжистый. Различают агглютинацию прямую, при кото­рой во взаимодействии со специфическими антителами непосредственно участву­ют собственные антигены бактериальной или любой другой клетки, например эритроцитов; и непрямую, или пассивную, при которой бактериальные клетки или эритроциты, или частицы латекса являются носителями не собственных, а сорбированных на них чужих антигенов (или антител) для выявления специ­фических к ним антител (или антигенов). В реакции агглютинации участвуют главным образом антитела, относящиеся к классам IgG и IgМ. Она протекает в две фазы: вначале происходит специфическое взаимодействие активного цент­ра антител с детерминантом антигена, эта стадия может происходить в отсут­ствие электролитов и не сопровождается видимыми изменениями реагирующей си­стемы. Для второй стадии — образования агглютината — необходимо наличие электролитов, которые снижают электрический заряд комплексов антиген + ан­титело и ускоряют процесс их склеивания. Эта фаза заканчивается образованием агглютината.

Реакции агглютинации ставят либо на стеклянных, либо на гладких картонных пластинках, либо в стерильных агглютинационных пробирках. Реакции агглюти­нации (прямые и пассивные) на стекле обычно применяют в качестве ускоренно­го метода обнаружения специфических антител в сыворотке больного (например, при бруцеллезе) или для серологической идентификации возбудителя. В послед­нем случае обычно используют хорошо очищенные (адсорбированные) диагнос­тические сыворотки, содержащие только монорецепторные антитела или их на­бор к различным антигенам. Несомненным достоинством реакции агглютинации на стекле является простота ее постановки и то, что она протекает несколько ми­нут или даже секунд, так как оба компонента в ней используются в концентриро­ванном виде. Однако она имеет лишь качественное значение и менее чувствитель­на, чем пробирочная. Развернутая реакция агглютинации в пробирках дает более точные результаты, ибо она позволяет определить количественное содержание антител в сыворотке (установить ее титр) и при необходимости зарегистрировать факт нарастания титра антител, что имеет диагностическое значение. Для поста­новки реакции в агглютинационные пробирки вносят определенным образом разведенную 0,85 % раствором NaС1 сыворотку и равный объем (обычно 0,5 мл) суспензии стандартного диагностикума (или исследуемой культуры), содержаще­го в 1 мл 1 млрд бактерий. Учет результатов реакции агглютинации производят предварительно через 2 ч инкубации пробирок при температуре 37 °С и оконча­тельно через 20—24 ч по двум признакам: наличию и величине осадка и степени прозрачности надосадочной жидкости. Оценку осуществляют по четырехкрест- ной системе. Реакция обязательно сопровождается контролем сыворотки и антиге­на. В тех случаях, когда развернутую реакцию агглютинации в пробирке ставят для серологической идентификации возбудителя, она имеет диагностическое зна­чение, если реакция оценена как положительная при разведении диагностической сыворотки не менее половины ее титра.

Необходимо учесть, что при смешивании растворов гомологичных антигенов и антител не всегда наблюдаются видимые проявления реакции агглютинации. Осадок образуется только при некоторых оптимальных соотношениях обоих компонентов реакции. Вне этих пределов, при значительном избытке антигена или антител, реакции не наблюдается. Это явление получило название «феномена прозоны». Оно наблюдается как при реакции агглютинации, так и при реакции преципитации. Появление прозоны в иммунных реакциях объясняется тем, что участвующие в них антигены, как правило, являются полидетерминантными, а мо­лекулы антител IgG имеют два активных центра. При избытке антител поверх­ность каждой частицы антигена покрывается молекулами антител так, что не остается свободных детерминантных групп, поэтому второй, несвязанный активный центр антител не может взаимодействовать с другой антигенной частицей и связывать их друг с другом. Образование видимого агглютината или преципитата подав­ляется также при избытке антигена, когда не остается ни одного свободного актив­ного центра антител, и поэтому комплексы антиген + антитело + антиген не могут более укрупняться.

31. Преципитирующие свойства иммунных сывороток. Использование преципитации в агаре и применение ее для изучения- антигенов и определения токсигенности дифтерийной палочки.

Реакция преципитации и ее варианты

Реакции агглютинации и преципитации очень близки по своей сути. Различия между ними зависят главным образом от величины частиц антигена. Преципитаци­ей называют процесс, когда происходит агрегация антител с растворимыми антиге­нами; если же антиген представлен корпускулами, специфическая агрегация таких антигенов описывается как агглютинация.

Появление преципитата при реакции антиген—антитело определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ро­лью Fс-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приво­дит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах. В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведен­ную сыворотку.

Для постановки реакции преципитации необходимы: антитела — испытуемая сы­воротка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); антиген — экстрагированный гаптен или полный гаптен со­ответствующих микроорганизмов; физиологический раствор как источник электро­литов. Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция коль- цепреципитации) и преципитация в геле.

Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой рас­творы антигенов и антител смешивают в пробирке. Учет реакции производят с по­мощью измерения на фотоэлектроколориметре мутности получаемой системы, что позволяет определить концентрацию исследуемого антигена.

Значительно чаще применяется качественная реакция кольцепреципитации. Для ее постановки в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не до­пуская перемешивания, раствор антигена. В случае гомологичности антител и ан­тигена на границе между этими растворами быстро, через 3—10 мин, появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а антигена.

Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индиви­дуальных антигенов в исследуемой жидкости и провести анализ их антигенного родства. В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в ге­ле, а другой — антиген — наслаивается на первый в виде раствора. Антиген, диф­фундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хоро­шо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще бо­лее простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий про­водить прямое сравнение различных ан­тигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследова­нии перекрестных реакций (рис. 73).

Для постановки реакции по Оухтерло­ню используют 1 %-ный агар, приготов­ленный на физиологическом растворе, ко­торый разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5—6 мм — одна в центре чашки, 4—5 — по окружно­сти на расстоянии 1—2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагнос­тическую преципитирующую сыворотку, а в периферические — раствор гомологич­ного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной темпера­туре. Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где со­здаются их эквивалентные концентрации,

образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, иду­щие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких ан­тигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных (см. рис. 73).

Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектро- форез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического раз­деления. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагности­ческим методом.

32. Литические свойства иммунных сывороток. Роль комплемента, механизм взаимо­действия комплемента с комплексом антиген-антитело. Серологические реакции, протекающие с участием комплемента

Реакция бактериолиза. Используется для серологической диагностики холеры. Феномен бактериолиза легко удается наблюдать in vitro. Исследуемую сыворотку наносят в последовательном двукратном разведении каплями на поверхность пита­тельной среды, на которую предварительно засевают культуру вибриона. Чашку с посевами инкубируют при температуре 37 "С в течение 18—20 ч. Под влиянием имеющихся в сыворотке антител и комплемента холерные вибрионы разрушаются (лизируются), и в местах нанесения капель образуются стерильные пятна. Антите­ла, разрушающие или умерщвляющие вибрионы, называют вибриоцидными. Тит­ром вибриоцидных антител считается максимальное разведение сыворотки, при ко­тором она еще вызывает отчетливый лизис бактерий.

Реакция иммобилизации трепонем. Применяется для диагностики сифилиса. Живые трепонемы в присутствии имеющихся в исследуемой сыворотке специфиче­ских антител и комплемента теряют свою подвижность.

Реакция гемагглютинации иммунного прилипания. В основе этой реакции лежит способность комплекса антиген + антитело в присутствии комплемента адсорбироваться на эритроцитах, вызывая их склеивание. Применяется для сероло­гической диагностики гепатита А. Характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, но требует использования высокоочищенного антигена и специ­ального подбора доноров эритроцитов.

Реакция гемолиза. Литическое действие иммунной сыворотки в присутствии комплемента особенно четко проявляется в отношении эритроцитов. Если кролика иммунизировать эритроцитами другого вида животных (барана), кроличья сыво­ротка приобретает специфическую гемолитическую активность, т. е. способность вызывать гемолиз эритроцитов, использованных для иммунизации. Этот эффект аб­солютно зависим от комплемента. Инактивация последнего путем прогревания сы­воротки при температуре 56 °С приводит к утрате ею гемолитической активности. Таким образом, наличие или отсутствие активного комплемента в гемолитической сыворотке очень четко выявляется по результатам ее взаимодействия с гомологич­ными эритроцитами: при наличии комплемента — гемолиз, образование «лаковой крови»; при его отсутствии — гемагглютинация, эритроциты выпадают на дно про­бирки, образуя осадок в виде зонтика, жидкость бесцветна.

33. Вакцины и их виды, способы приготовления и применения. Токсины и анатоксины. Отечественные вакцинные препараты. Успехи и задачи здравоохранения в борьбе с инфекционными болезнями.

Вакцина — медицинский препарат, предназначенный для создания иммунитета к инфекционным болезням.

Классификации вакцин:

1.Живые вакцины - препараты, действующим началом в которых являются ослабленные тем или иным способом, потерявшие свою вирулентность, но сохранившие специфическую антигенность штаммы патогенных бактерий. Примером таких вакцин являются БЦЖ и вакцина против натуральной оспы человека, в качестве которой используется непатогенный для человека вирус оспы коров.

2.Инактивированные (убитые) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе проективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины). В препараты иногда добавляют консерванты и адьюванты.

Молекулярные вакцины – в них антиген находится в молекулярной форме или даже в виде фрагментов его молекул, определяющих специфичность т. е. в виде эпитопов, детерминант.

Корпускулярные вакцины – содержащие в своем составе протективный антиген

3.Анатоксины относятся к числу наиболее эффективных препаратов. Принцип получения – токсин соответствующей бактерии в молекулярном виде превращают в нетоксичную, но сохранившую свою антигенную специфичность форму путем воздействия 0.4% формальдегида при 37t в течение 3-4 недель, далее анатоксин концентрируют, очищают, добавляют адьюванты.

4.Синтетические вакцины. Молекулы эпитопов сами по себе не обладают высокой иммуногенностью для повышения их антигенных свойств эти молекулы сшиваются с полимерным крупномолекулярным безвредным веществом, иногда добавляют адьюванты.

5.Ассоциированные вакцины – препараты, включающие несколько разнородных антигенов.

Способы приготовления.

Инактивированные (убитые, корпускулярные или молекулярные) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе проективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины).

Для выделения из бактерий и вирусов антигенных комплексов (гликопротеинов, ЛПС, белков) применяют трихлоруксусную кислоту, фенол, ферменты, изоэлектрическое осаждение.

Их получают путем выращивания патогенных бактерий и вирусов на искусственных питательных средах, инактивируют, выделяют антигенные комплексы, очищают, конструируют в виде жидкого или лиофильного препарата.

Преимуществом данного типа вакцин является относительная простота получения (не требуется длительного изучения и выделения штаммов). К недостаткам же относятся низкая иммуногенность, потребность в трехкратном применении и высокая реактогенность формализированных вакцин. Так же, по сравнению с живыми вакцинами, иммунитет, вызываемый ими, непродолжителен.

В настоящее время применяются следующие убитые вакцины: брюшнотифозная, обогащенная Vi антигеном; холерная вакцина, коклюшная вакцина

Живые вакцины - препараты, действующим началом в которых являются ослабленные тем или иным способом, потерявшие свою вирулентность, но сохранившие специфическую антигенность штаммы патогенных бактерий.

Аттенуация (ослабление) возможна путём воздействия на штамм химических (мутагены) и физических (температура) факторов или посредством длительных пассажей через невосприимчивый организм. Так же в качестве живых вакцин используются дивергентные штаммы (непатогенные для человека), имеющие общие протективные антигены с патогенными для человека микробами. Примером такой вакцины является БЦЖ и вакцина против натуральной оспы.

Возможно получение живых вакцин генно-инженерным способом. Принцип получения таких вакцин сводится к созданию непатогенных для человека рекмбинантных штаммов, несущих протективные антигены патогенных микробов и способных при введении в орг. человека размножаться и создавать иммунитет. Такие вакцины называют векторными.

Вне зависимости от того, какие штаммы включены в вакцины, бактерии получают путём выращивания на искусственных питательных средах, культурах клеток или куриных эмбрионах. В живую вакцину, как правило, добавляют стабилизатор, после чего подвергают лиофильному высушиванию.

Молекулярные вакцины – в них антиген находится в молекулярной форме или даже в виде фрагментов его молекул, определяющих специфичность т. е. в виде эпитопов, детерминант.

В процессе культивирования природных патогенных микробов можно получить протективный антиген, синтезируемый этими бактериями токсин затем превращается в анатоксин, сохраняющий специфическую антигенность и иммуногенность. Анатоксины являются одним из видов молекулярных вакцин. Анатоксины – препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные своих токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Получение: токсигенные бактерии выращивают на жидких средах, фильтруют с помощью бактериальных фильтров для удаления микробных тел, к фильтрату добавляют 0,4% формалина и выдерживают в термостате при 30-40t на 4 недели до полного исчезновения токсических свойств, проверяют на стерильность, токсигенность и иммуногенность. Эти препараты называются нативными анатоксинам, в настоящее время почти не используются, т. к. содержат большое количество балластных веществ, неблагоприятно влияющих на организм. Анатоксины подвергаю физической и химической очистке, адсорбируют на адъювантах. Такие препараты называются адсорбированными высокоочищенными концентрированными анатоксинами.