2.5.14. Визначення концентрації білка у безклітинних екстрактах методом Лоурі
Реактиви:
А ─ 2 % р-н Na2CO3 в 0.1 н NaOH;
Б ─ 0,5 % р-н СuSO4·5H2O в 1 % цитраті натрію;
В ─ 1 мл р-ну А змішують з 50 мл р-ну Б;
С ─ реактив Фоліна-Чокальтеу розводять водою до кінцевої концентрації 1 н.
Д
о
100 мкл досліджуваного розчину додавали1
мл р-ну В, залишали стояти при кімнатній
температурі 10 хв. До одержаної суміші
швидко додавали 100 мкл р-ну С, енергійно
перемішували і через 40 хв вимірювали
величину екстинкції при 750 нм в кюветі
1 см.
Калібрувальну криву будували за розчином бичачого сироваткового альбуміну відомої концентрації - 10-100 мкг/мл.
2.5.15. Визначення активності лужної фосфатази
Метод грунтується на здатності лужної фосфатази розщеплювати фосфорильовані субстрати, зокрема, р-нітрофенілфосфат (pNPP), з утворенням забарвленої сполуки р-нітрофенолу.
Отриманий безклітинний екстракт розводили 50мМ Tris-HCl pH 7,5 буфером до кінцевої концентрації білка 0,025-0,05 мг/мл та розкапували по 100 мкл в мікропробірки. До кожного зразка додавали по 0,6 мл дистильованої води, 100 мкл 0,1 М MgCl2x6H2O і 100 мкл 0,5 М Tris-HCl pH 8,9.
Реакцію запускали, додаючи 100 мкл 0,1 М pNPP та вимірювали зміну оптичної густини в кінетиці протягом 10 хв (довжина хвилі 410 нм, кювета 1 см).
Активність лужної фосфатази обчислювали за формулою:
А= ∆OD410 / (18 × P × t), де ∆OD410 – зміна оптичної густини продукту; 18 – оптична густина розчину 1 ммоль/мл р-нітрофенолу; P– концентрація білка, мг/мл; t – тривалість реакції, хв.
3. Результати
3.1 Модифікація гена kanMx4, що забезпечує резистентність до антибіотика генетицину.
Ген kanMX4 застосовується як гетерологічний домінантний селективний маркер для S. cerevisiae. Наявність щонайменше однієї копії цього гена в геномній ДНК дріжджів забезпечує їх резистентність до антибіотика генетицину (в концентрації 200 мг/л для S. cerevisiae). Було поставлено завдання модифікувати ген kanMX4 таким чином, щоб він працював менш ефективно. Тоді для селекції дріжджових трансформантів необхідна наявність багатьох копій модифікованого селективного маркера в геномі відповідних штамів. Селекцію модифікованого гена kanMX4 здійснюють в клітинах E. coli. Для цього спочатку визначають мінімальну концентрацію генетицину, що здатна інгібувати ріст культури E. coli – це 2 мг генетицину на 1 л середовища. В подальшому проводять ПЛР з використанням праймерів Ко446 та Ко447 (див. табл. 1) на матриці плазміди pRS303K, що містить у своєму складі ген kanMX4, за умов, що сприяють виникненню великої кількості помилок при копіюванні ланцюга ДНК (висока концентрація йонів Mg2+, наявність йонів Mn2+, непропорційні концентрації нуклеотидтрифосфатів у реакційній суміші, використання ДНК-полімерази з низькою точністю зчитування). Сукупність ампліфікованих фрагментів ДНК, що містять у своєму складі різноманітні нулеотидні заміни, обробляють ендонуклеазою рестрикції XbaI і клонують у відповідний сайт плазміди pUC57. Відбір трансформантів E. coli, що містять плазміду зі вставкою, проводять на середовищі з ампіциліном (100 мг/л) та генетицином (2 мг/л). Отримані колонії трансформантів за допомогою методу реплік переносять на середовище з вищою концентрацією генетицину (10 мг/л) і відбирають трансформанти, що не здатні рости при такій концентрації антибіотика. У подальшому з одного з відібраних трансформантів E. coli отримують плазміду, що містить у своєму складі модифікований ген kanMX4.