2.5.10. Довготривале зберігання бактерійних та дріжджових трансформантів

Для довготривалого зберігання бактерійні трансформанти вирощують в пробірках (3 мл) селективного середовища при 37^оС протягом ночі. Клітини осаджують центрифугуванням при 4000 об/хв протягом 5-10 хв. 0,5 мл клітин вносять у мікропробірку з 0,5 мл 70 % стерильного холодного гліцерину, заморожують та зберігають при -70 ^оС.

Дріжджові трансформанти вирощують в пробірках (3 мл) YPМ середовища при 30^оС протягом ночі. Клітини осаджують центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 5-10 хв. 0,5 мл клітин вносять у мікропробірку з 0,5 мл 70 % стерильного холодного гліцерину, заморожують та зберігають при -70^оС.

2.5.11. Трансформація дріжджів s. Сerevisiae Li-Ac методом (хімічна трансформація)

1. В 200 мл (100 мл) YPМ інокулюють 1 мл (0,5 мл) нічної культури дріжджів та вирощують до ОД₆₀₀ = 1.

2. Клітини осаджують, промивають стерильною водою, та ресуспендують у 1 мл LiAc/TE буферу (0.1М Літій ацетат , 10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA pH=7.5).

3. Інкубують протягом години при 30ºС, повторно осаджують клітини і ресуспендують у свіжому LiAc/TE буфері до концентрації 5×10⁹ клітин/мл (OD₆₀₀ ≈100).

4. Додають аліквоти клітин по 50 мкл

5. 0,5 – 10 мкг ДНК (в ≤ 10 мкл об’ємі) та 250 мкл 50% поліетиленгліколю у суміші із трансформаційним буфером додають до суспензії. Інкубують при 30 ^оС протягом 30 хв.

6. Клітини переносять на водяну баню, витримують 15 хв при 42ºС, після чого переносять на лід на 1 хв.

7. Клітини осаджують 10 хв при 3000 об/хв і ресуспендовують в 1 мл YPМ. Інкубують 1,5-2 години та висівають на селективне середовище.

8. Інкубують протягом 3-5 днів при 30 ºС.

2.5.12. Визначення стабільності дріжджових трансформантів

Окремі клони трансформантів засівають у рідке неселективне поживне середовище (YРМ) та інкубують при 37°С протягом 15 генерацій (22,5 год. для S. сerevisiae). Клітинну суспензію розводять і засівають на чашки з неселективним агаризованим YРМ. Інкубують протягом 2 діб при 30°С та роблять відбитки колоній на чашки з селективним середовищем (YPD + зеоцин, YPD + генетицин, YNB + leu, ura, trp). Після інкубації протягом 3 діб, 30°С визначають кількість клітин, що зберегли потрібний фенотип.

2.5.13. Отримання безклітинного екстракту

Дріжджові клітини осаджували центрифугуванням на 3000 g протягом 3 хв при 4⁰С в мікропробірках типу еппендорф. Супернатант відбирали, а клітини промивали 1 мл дистильованої води та двічі буфером для промивання за тих же умов центрифугування. Клітини, що залишилися, зберігали на -20⁰С і використовували для приготування безклітинного екстракту.

До мікропробірок типу еппендорф із досліджуваними клітинами додавали „балотіні” (скляні кульки) рівного об’єму і такий же об’єм буферу для руйнування клітин. Руйнували на дезінтеграторі протягом 2 хв (6 разів з двохвилинним охолодженням). Гомогенат центрифугували на 14000g×20 хв при +4⁰С. Отриманий екстракт використовували для визначення білка та активності фермента лужної фосфатази.

Буфер для руйнування клітин: 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 2 mM EDTA.