2.5.7. Електротрансформація клітин е. Сoli

Свіжу колонію бактерійних клітин інокулюють в 2 мл рідкого середовища LB та вирощують в умовах аерації при 37⁰С протягом ночі. 1 мл „нічної” культури переносять в 100 мл рідкого середовища LB та підрощують до ОD ₆₀₀ = 0,5 – 1,0 (кювета 1 см), що відповідає 10¹⁰ кл./мл. Клітини осаджують 15 хв. при 4 000 об./хв., 4⁰С і промивають в 400 мл стерильній холодній бідистильованій воді. Клітини ресуспендують в 200 – 300 мкл холодного стерильного 10 % гліцерину і переносять в стерильні епендорфи по 40 мкл для довготривалого зберігання при – 70⁰С.

До 40 мкл суспензії клітин додають 1-4 нг плазмідної ДНК (зразок) і вносять суміш на дно охолодженої 2-мм кювети; здійснюють електротрансформацію (12,25 кВ/см, 50 мкФ, 129 Ом) тривалістю 5-6 мс. До кожного зразка додають по 960 мкл рідкого середовища LB, трансформовані клітини інкубують протягом 1 год при 37⁰С. Отриману суспензію висівають на чашки з селективним середовищем та інкубують від 12 до 16 годин при 37⁰С.

2.5.8. Полімеразна ланцюгова реакція (плр)

Для забезпечення протікання кількох паралельних реакцій готували реакційну суміш, у склад якої входили вода, буфер, дезоксинуклеотидтрифосфати (дНТФ), праймери і полімераза, в одному епендорфі, а потім розділяли на кілька окремих проб. Після розділення додавали розчин ДНК. Дані реакції проводилися на ампліфікаторі Gene Amp© PCR System 9700.

Склад реакційної суміші

реагент кінцева концентрація

стерильна деіонізована вода -

10х PCR буфер 1х

2 мМ суміш дНТФ 0,2 мМ кожного

праймер 1 0,1-1 мкл

праймер 2 0,1-1 мкл

полімераза 1,25 u/ 50мкл

матриця ДНК 10 пг- 1 мкг

2.5.9. Виділення хромосомної днк з клітин s. Сerevisiae

Реактиви:50мМ ЕДТА (рН 8,0); літиказа (50 мг/мл); ізопропанол; 70% етанол; РНКаза А; Фенол; 96% етанол; 5 М калій ацетат; 3 М натрій ацетат; Nuclei Lysis Solution: 0,2% ДСН; 50мМ ЕДТА (рН 8,0).

Культуру клітин підрощували протягом ночі у поживному середовищі (3 мл) при температурі 28-30˚С. Культуру осаджували при 13000 g потягом 2 хвилин. Клітини ресуспендували в 293 мкл 50мМ ЕДТА та додавали 7 мкл літикази (концентрація 20 мг/мл) і перемішували. Клітини інкубували при 37˚С протягом години для руйнування клітинної стінки. Після цього клітини осаджували, додавали 300 мкл Nuclei Lysis Solution та інтенсивно піпетували. Епендорфи прогрівали при температурі 65˚С протягом 15 хвилин. Потім додавали 100 мкл 5 М калій ацетату для осадження білків. Білки відділяли центрифугуванням при 13000 g потягом 3 хвилин. Супернатант додавали у епендорфи до 0,7 обєму ізопропанолу, центрифугували при 13000 g 2 хв, промивали в 500 мкл 76% етанолу, висушували, розчиняли в 100 мкл дистильованої води.

Потім додавали рівний об’єм фенолу, перемішували, центрифугували при 14000 об/хв 10 хв. Верхню (водну) фазу відбирали, до неї додавали 1/10 об’єму 3 М натрій ацетату і 2,5 об’єми 96% етанолу. Інкубували при температурі -20°С 10-15 хв. Суміш центрифугували при 14000 об/хв 10 хв при температурі +4°С, осад ДНК промивали 76% етанолом. Розчиняли в дистильованій воді чи ТЕ буфері.