2. Матеріали і методи досліджень

2.1. Матеріали досліджень

У роботі були використані хімічні сполуки, реактиви та ферменти виробництва фірм: «Sigma» (США), «Fluka» (Німеччина), «Fermentas» (Литва), «NEB» (США), «Promega» (США). Кваліфікація хімічних реактивів вітчизняного виробництва - “хч” та “осч”.

2.2. Організми

Для рутинних генно-інженерних маніпуляцій використовували штам E. сoli DH5α (lacZΔM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(r_K^-, m_K⁺), supE44, relA1, deoR, Δ(lacZYA-argF)U169). Для отримання трансформантів дріжджів використовували лабораторний штам S. сerevisiae BY4742 (MATα, his3Δ1, leu2Δ0, lys2Δ0, ura3Δ0; Giaever et al., 2002), а також промисловий штам S. сerevisiae AS400.

2.3. Поживні середовища та умови культивування

Клітини дріжджів та бактерій вирощували у пробірках об’ємом 20 мл, що містили 3 мл середовища, колбах на 300 мл та 50 мл, що містили 100 мл та 20 мл середовища відповідно, на круговій качалці, та на чашках Петрі з 25 мл агаризованого середовища в термостаті при 37⁰С для бактерій та 30⁰С для дріжджів. Для виділення плазмідної ДНК з клітин E. coli штами вирощували на середовищі LB при 37°C протягом 18 годин (Sambrook and Rusell 2001).

В експериментах були використані середовища такого складу:

YNB min, г/л: (YNB (Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and amonium sulfate) – 1,7; (NH₄)₂SO₄ – 5; Глюкоза – 20

При вирощуванні штамів, ауксотрофних по лейцину, гістидину, лізину, урацилу в середовище додавали згадані фактори росту у концентрації 40 мг/л.

YPD, г/л: (Дріжджовий екстракт (YЕ) – 10; Пептон – 10; Глюкоза – 20).

LB (Лурія-Бертані), г/л: (Пептон – 15; NaCl – 10; YE – 5).

рН 7,0 доводили 2н NaОН з розрахунку 100 мкл/100 мл для рідкого і агаризованого середовища.

Агаризовані середовища містили агар (2%).

Селекцію рекомбінантних штамів проводили на середовищах з додаванням ампіциліну (100 мг/л) та генетицину (200 мг/л).

2.4. Визначення біомаси клітин

Біомасу клітин S. cerevisiae (в мг абсолютної маси на 1 мл суспензії) визначали за мутністю розведених суспензій за допомогою спектрофотометра (СФ) Helios Gamma UV-Visible Spectrophotometer (Thermo Spectronic) при λ = 600 нм в кюветі 1 см.

Розрахунок проводили за формулою:

Е₆₀₀n

С = ,

3,3

де Е₆₀₀ – OD при 600 нм;

n – розведення вихідної суспензії;

3,3 – коефіцієнт перерахунку, визначений при калібруванні гравіметричним методом.

2.5. Методи досліджень

2.5.1. Рестрикційний аналіз днк

Метод базується на здатності ендонуклеаз рестрикції ІІ класу гідролізувати ДНК в певних сайтах (послідовностях нуклеотидів). В роботі використовували ферменти та відповідні інкубаційні буфери виробництва фірми “Fermentas” (Литва).

У реакційну суміш вносили 0,5-2 мкг аналізованої ДНК в ТЕ-буфері чи бідистильованій воді. До розчину ДНК додавали 1/10 об’єму відповідного буферу і 1 од.акт. ферменту на 1мкг плазмідної ДНК, реакційну суміш доводили водою до відповідного об’эму. Суміш інкубували при 37^оС 1-2 години.

2.5.2. Дефосфорилювання

До розчину ДНК 10-40 мкл (1-20 пкмоль кінців) додавали 5 мкл 10х-буферу для реакції дефосфорилювання, 1 мкл лужної фосфатази і об'єм доводили до 50 мкл водою. Суміш інкубували протягом 30 хв при 37°С. Після цього ДНК очищували за допомогою фенолу або наносили на колонки.