3. Альтернативні системи мультикопійної інтеграції векторів у Saccharomyces cerevisiae

3.1 Альтернативна система мультикопійної інтеграції у Saccharomyces cerevisiae з використанням субтеломерних y’-елементів

Як було зазначено вище, дріжджі Saccharomyces cerevisiae найбільш широко використовуються у молекулярній біології і біотехнології. S. cerevisiae є основним вибором біотехнологічної індустрії, яка швидко поширюється, оскільки вона вимагає нових модельних організмів для продукції великої кількості речовин (білків, амінокислот, органічних кислот, полісахаридів, багатоатомних спиртів, вітамінів і вітамінних добавок, і.т.д) і бактерійні системи не завжди спроможні до виконання функцій активних продуцентів речовин. Будучи еукаріотичним організмом, S. cerevisiae здатний продукувати комплекс білків клітин ссавців, але таке застосування дріжджів вимагає розробки для них нових методів для надпродукції даних речовин. За досить короткий проміжок часу було розроблено велику кількість методів для введення чужорідних генів у клітини дріжджів у складі векторів, що забезпечують мультикопійну трансформацію вставки. Ці методи включали способи введення одно- і мультикопійних плазмід у геном. Такі плазміди утворюють більше, ніж 100 копій на клітину, і, як наслідок, їхня ефективна ампліфікація обмежується декількома факторами. По-перше, векторні плазміди є нестабільними у неселективних умовах. По-друге, чим більше генів вводиться в один вектор, тим більш нестабільним він стає і проведення ефективної трансформації дріжджів стає важким завданням. Для вирішення цих проблем були розроблені інтегративні підходи для здійснення ефективної мультикопійної інтеграції векторів у геном.

Перший з них базується на інтеграції потрібних генів у локус рДНК. рДНК-локус – послідовність нуклеотидів у геномній ДНК дріжджів довжиною 1-2 млн пар основ, що містить 200 тандемних повторів довжиною 9,1 тис. пар основ. Ці тандемні повтори розглядаються як зручний варіант для мультикопійної інтеграції. Однак детальний аналіз ДНК, інтегрованої у рДНК виявив, що, незважаючи на велику кількість можливих мішеней інтеграції, чужорідна ДНК вбудовується у дуже малу кількість сайтів і тільки після цього реплікується в умовах селективного тиску, який створюється спеціально підібраними селективними маркерами.

Другий з підходів, розроблений співробітниками Інституту біотехнології Вільнюского університету у 2011 році, базується на інтеграції субтеломерних Y’ділянок.

Y’-елементи – специфічні послідовності у геномі S. cerevisiae, що мають від 0 до 4-х копій. Встановлено, що 2/3 субтеломерних ділянок містять такі елементи. Крім того, Y’-елементи не кодують ніяких життєво важливих генів, що робить їх перспективним кандидатом для введення чужорідних генів у геном. Y’-елементи також є стійкими до сайленсингу теломер, що сприяє їх ефективній експресії.

Для того, щоб створити зручну систему для генної інтеграції у субтеломерні регіони було зконструйовано вектор під назвою pTELY. У вихідну векторну плазміду pUC57 був клонований Y’-елемент розміром 2 тис. пар основ по EcoRI сайту. Крім того, ця вставка була фланкована 4-ма 8-нуклеотидними сайтами рестрикції (MssI, MreI, NotI, SfaAI) для забезпечення ефективної лінеаризації конструкції. Всередину цієї ділянки був поміщений полілінкер, що містив 12 сайтів дії ендонуклеаз рестрикції. На кінцевому етапі ген URA3(забезпечує ауксотрофність по урацилу) був вбудований у кінець полілінкера в якості селективного маркера. Ген URA3 був фланкований His-G - прямими повторами бактерій. В проведених операцій було отримано вектор pTELY-HisG-URA3 (Рис 7):

Рис 7. Плазмідний вектор pTELY-HisG-URA3.

Для перевірки можливості мультикопійної інтеграції URA3 у складі плазміди в у субтеломерний локус було визначено кількість копій вектора і перевірено стабільність у неселективних умовах. Крім того, було порівняно 3 наявних шляхи трансформації дріжджів: одно- і мультикопійною плазмідою, а також інтеграцією у рДНК-локус. В роботі використовувалия такі конструкції:

- pRS316 – однокопійна плазміда; (Sikorski & Hieter, 1989),

- pRS426 – мультикопійна плазміда; (Christianson et. al.,1992)

• IGS1-послідовність, яка вбудовувалася у рДНК-локус; (James, et al., 2009)

• досліджувана плазміда pTELY.

Вектор pTELY був лінеаризований рестриктазою Not1 і трансформований у штам, в якого був делетований ген ura3. Специфічність інтеграції була підтверджена за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР). Аналогічна процедура була проведена для генерації великої кількості клонів з геном URA3,який був вбудований у рДНК-локус. Вектор,що містив ген URA3, фланкований IGS1-послідовностями був лінеаризований та траснформований у штам-делетант по ura3-гену. Після проведення кожної з трансформацій (pRS316, pRS426, рДНК, pTELY) було відібрано по 7 клонів і вирощено на чашках з YPD зі зміною 75-ти генерацій. Після росту трансформантів у неселективних умовах з них була виділена тотальна ДНК і визначена точка перетину значень рівня експресії URA3-гену методом ПЛР у реальному часі. Для визначення кількості URA3