Простые или “разрезанные”а-в токсины

Простые или “разрезанные” токсины синтезируются в бактериальных клетках в виде единой неактивной полипептидной цепи. В активную форму протоксин превращается в результате разрезания его протеазой. Образующийся при этом активный токсин состоит из двух связанных между собой дисульфидными связями пептидных цепей. Активация токсина (разрезание полипептидной цепи) может осуществляться либо собственной бактериальной протеазой, либо протеазами кишечного тракта макроорганизма. Такой тип экзотоксинов синтезирует C. tetani, C. botulinum, причем в их токсинах содержатся дополнительные белки с иными, нетоксическими свойствами.

Соединение токсина с рецептором клетки осуществляется посредством определенного участка молекулы. Установлено, что экзотоксины представляют собой биологически активные макромолекулярные системы с двумя четко разграниченными функциями. Одна часть молекулы содержит активированные группы, ответственные за специфическое патогенетическое действие токсина. Другая часть несет акцепторные группы, ответственные за присоединение токсина к определенным рецепторным структурам на чувствительной клетке. Взаимодействие токсина с чувствительной клеткой, приводящее к развитию интоксикации, осуществляется в несколько последовательных этапов и связано с его активацией.

Подробный механизм действия и активации простых токсинов рассмотрим на примере токсина Corynebacterium diphtheriae.

Токсин Corynebacterium diphtheriae

Corynebacterium diphtheriae продуцирует мощный экзотоксин (его впервые получили Ру и Йерсен в 1888 году), представляющий собой одноцепочечный белок с Мм 60 000 и двумя внутренними дисульфидными связями. Токсин проявляет все свойства экзотоксина – термолабильный, высокотоксичный, иммуногенный белок, нейтрализуемый антитоксической сывороткой, имеет инкубационный период действия, высаливается (NH₄)SO_4, теряет активность при 40 ⁰С и под действием 0,4 % раствора формалина. Кристаллический токсин содержит 51,47 % углерода, 6,75 % водорода, 16,0 % азота, 0,75 % серы и 0,05 % фосфора.

Для токсинообразования in vitro питательная среда должна быть дополнена аминокислотами, пептонами и солями Zn²⁺ , Cu²⁺ , Mg²⁺ , Mn²⁺ , Fe²⁺ и др.; последние должны присутствовать в строго определенных количествах; особую значимость имеет содержание солей железа.

Токсин неустойчив во внешней среде; разрушается под действием света и при нагревании до 60 ⁰С. Активность токсина выражают в единицах Dlm: 1 ЕД Dlm дифтерийного токсина равна наименьшей концентрации, убивающей морскую свинку массой 250 г на 4-5 сутки (около 0,00025-0,0001 мл). Для получения анатоксина (ослабленного нагреванием при 40 ⁰С дифтерийного токсина) используют штамм C. diphtheriae PW-8.

При культивировании in vivo и, очевидно, in vitro микроб продуцирует токсин в виде единых неактивных белковых молекул, которые активируются под действием протеолитических ферментов и тиоловых соединений. Чтобы перевести интактный токсин в активное состояние, необходимо восстановить дисульфидные группировки, а пептидную связь, находящуюся между атомами серы внутреннего дисульфидного мостика, гидролизовать. Протеолиз является как бы подготовительным этапом, открывающим доступ к дисульфидному мостику, соединяющему два фрагмента молекулы токсина.

У простых токсинов, в частности токсина C. diphtheriae, в результате протеолиза происходит расщепление одноцепочечной молекулы с образованием бифункциональной системы, состоящей из активаторного и акцепторного фрагментов. Так, активация дифтерийного токсина происходит под действием протеолитических ферментов и тиоловых соединений и сопровождается расщеплением пептидной связи и восстановлением дисульфидных группировок в сульфгидрильные (рис. 6). В результате образуется два соединенных между собой

Рис. 6. Схема активации дифтерийного токсина

полипептидных фрагмента, отличающихся по физико-химическим свойствам. Аминотерминальный фрагмент А имеет Мм 22000-24000 и характеризуется высокой устойчивостью к действию температуры, кислот и щелочей, СООН-терминальный фрагмент В с Мм 38000-39000 – высоколабилен. Фрагмент А выполняет функцию активатора и проявляет активность только в присутствии В-фрагмента, ответственного за акцепторную функцию.

Значение активации протоксинов протеолизом заключается в том, что она ведет к появлению у них ферментативной АДФ-рибозилтрансферазной активности. Считается, что в результате протеолиза в молекуле токсина происходят конформационные изменения, открывающие доступ к структуре каталитического центра этой активности, который скрыт в интактной молекуле протоксина.

После активации токсин ингибирует важную для жизнеобеспечения клетки-мишени функцию путем двухступенчатого NAD-зависимого процесса. Активаторная часть токсина проникает внутрь клетки и вызывает гидролиз NAD с образованием аденозиндифосфорибозы (АДФ-рибозы)и никотинамида, а затем осуществляет перенос АДФ-рибозы на соответствующий субстрат клетки-мишени. В качестве субстрата выступает тот или иной ключевой фермент клеточного метаболизма, блокада которого вследствие присоединения АДФ-рибозы вызывает нарушения, обусловливающие специфический эффект.

Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, инфицированные бактериофагом (b-фаг), несущим ген tox, кодирующим структуру токсина. Образование последнего наиболее выражено при вступлении батериальной популяции в стадию отмирания; переход умеренного фага в литическую форму мало влияет на синтез токсина.

Еще в 50-е годы было установлено, что нетоксигенные штаммы C. diphtheriae превращаются в токсигенные путем лизогенизации бактериофагом b или некоторыми близко родственными фагами. Длительное время оставалось неизвестным, какую функцию выполняет геном фага в биосинтезе токсина: контролирует ли биосинтез токсина определенная область фагового генома или участие фагового генома носит опосредованный характер. Решить этот вопрос удалось в сравнительных опытах по лизогенизации нетоксигенных дифтерийных бактерий нормальными и дефектными мутантами умеренных b-фагов. Был получен мутант фага b - фаг b_45. При фаговой конверсии, культура, инфицированная фагом b_45, так же, как культура, зараженная нормальным умеренным b-фагом, осуществляла железозависимый синтез белка. Однако белок, синтезированный при участии дефектного фага b₄₅, не обладал токсическими свойствами и по молекулярному весу был меньше, чем дифтерийный токсин. Его молекулярный вес был равен 45 000 дальтон по сравнению с 62 000 нормального токсина. Протеолиз нетоксигенного белка и обработка его дитиотриетолом приводили, как и в случае токсина, к возникновению двух фрагментов, один из которых, соответствующий пептиду А, имел такой же молекулярный вес (24 000 дальтон). Другой же фрагмент имел молекулярный вес не 38 000, как фрагмент В, а 21000 дальтон.

Фрагмент с молекулярным весом 24000 дальтон был серологически идентичен фрагменту А токсина. Как выяснилось позднее, за счет фрагмента А нетоксичный белок обнаруживал частичное родство в серологических тестах с нормальным дифтерийным токсином.

При сравнительном изучении В-фрагментов дефектного белка и токсина было установлено, что в полипептиде с молекулярным весом 21 000 дальтон (фрагмент В дефектного белка ) отсутствует С-терминальный участок, равный 17 000 дальтон. Между тем, указанный участок, играет чрезвычайно важную роль в проявлении токсином его функциональной активности.

Дифтерийный экзотоксин, переведенный с помощью формалина в нетоксическую форму, обладает выраженными антигенными свойствами и используется для создания защитного антитоксического иммунитета против дифтерии.

Каждый из пептидов в отдельности (фрагмент А и В) вызывает образование антител у иммунизированных ими животных и реагирует с гомологичными антителами в серологических тестах. Между собой фрагменты А и В серологически неидентичны. В антитоксической дифтерийной сыворотке 1/3 составляют антитела к фрагменту А, 1/3 – антитела к молекуле токсина, лишенной участка с молекулярным весом 17 000 дальтон, и 1/3 – антитела участку фрагмента В с молекулярным весом 17 000 дальтон.

Иммунохимическое изучение фрагментов А и В с лошадиной и кроличьей антитоксическими сыворотками позволило картировать локализацию антигенных детерминант на молекуле токсина и установить их значение для защитного антитоксического иммунитета при дифтерии. Показано, что особое значение имеют антигенные детерминанты, локализованные на С-терминальном участке фрагмента В (участок с молекулярным весом 17 000). Они нейтрализуют токсическое действие in vivo, предотвращая, как предполагают, присоединение В-фрагмента к клеточной мембране. В результате чего фрагмент А лишается возможности проникнуть в цитоплазму.

Антитела к фрагменту А не защищают животных от действия токсина, хотя и нейтрализуют энзиматическую активность указанного пептида. Предполагается, что антигенные детерминанты А-фрагмента маскированы в интактном токсине и могут высвобождаться либо после протеолиза, либо в результате деградации более лабильного фрагмента В.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в последнее время в области изучения структуры дифтерийного экзотоксина, механизм его действия в значительной степени остается неясным. Основная функция дифтерийного экзотоксина сводится к подавлению белкового синтеза в клетках организма хозяина. При этом к действию токсина чувствительно только небольшое число видов животных, хотя в опытах in vitro показано, что ингибирование белкового синтеза под действием токсина наблюдается у любых эукариотических клеток, включая растительные. На биосинтез белка прокариотными клетками токсин не оказывает никакого влияния. В клетках эукариотов дифтерийный токсин ингибирует белковый синтез путем блокирования трансферазы II, участвующей в биосинтезе на стадии <<трансляции>>. В клетках прокариотов трансфераза II отсутствует, а ее функцию выполняет другой фермент, что является является решающим фактором в невосприимчивости прокариотных клеток к действию дифтерийного токсина

Биологическое действие дифтерийного токсина связано с его способностью подавлять синтез белка в клетке-мишени путем инактивации фактора элонгации-2 (EF-2), участвующего в синтезе белка на стадии трансляции. После активации дифтерийный токсин фиксируется при помощи фрагмента В на соответствующем рецепторе клетки, а активаторный фрагмент А, проникнув в клетку, гидролизует NAD с образованием АДФ-рибозы и осуществляет перенос ее на фактор элонгации.

В результате акцепции АДФ-рибозы на EF-2 образуется неактивный комплекс, не способный участвовать в процессе синтеза белка. Прекращение синтеза белка ведет к нарушению нормальных физиологических функций клетки и ее гибели. Мишенью действия дифтерийного токсина может быть любая ткань, однако наиболее часто он поражает мышцу сердца, кору надпочечников, нервные клетки. Результат действия токсина на нервную ткань – демиелинизация нервных волокон, что часто приводит к параличам и парезам.

Изучение мембранных рецепторов эукариотических клеток для дифтерийного токсина в настоящее время находится в стадии интенсивного поиска. Проблема осложняется тем, что для ингибирования белкового синтеза в клетках чувствительных тканей требуется, видимо, всего несколько молекул токсина. В то же время методы, применяемые с этой целью для изучения других токсинов, не обладают достаточной разрешающей способностью, позволяющей улавливать дифтерийный токсин в количестве нескольких молекул. Эта основная методическая трудность является главным препятствием на пути установления химической природы и структуры рецепторов для токсина C. diphtheriae.

Экзотоксины C. botulinum

Ботулинические токсины относятся к категории простых токсинов, так как состоят из одной полипептидной цепи. Известно несколько серологически различных типов ботулинических нейротоксинов. Однако по характеру биологического действия все они сходны, что указывает на наличие общих токсических свойств в их белковой молекуле. Cчитают, что ботулинические токсины четырёх типов (А, В, Е, F) имеют основной токсический компонент, характеризующийся молекулярным весом 150 000 и константой Сведберга, приблизительно равной 7 S. В нативном состоянии каждый из токсинов ассоциирован с нетоксическим компонентом, величина которого варьирует и в итоге определяет размер токсического комплекса.

Нетоксическим компонентом в кристаллическом препарате токсина типа А является гемагглютинин. Токсический компонент связан с гемагглютинином нековалентно, и в кислых растворах такой комплекс по ряду физико – химических показателей ведёт себя как гомогенный препарат.

Комплекс токсина и гемагглютинина стабилен в интервале значений рН от 9,5 и сохраняет длительное время активность. Токсин без гемагглютинина быстро инактивируется даже на холоде. На одну весовую часть токсического компонента приходится от 4 до 9 частей гемагглютинина.

Рис. 7. Схема структуры нативного комплекса токсина и гемагглютинина C. botulinum типа А

По данным электронно-микроскопического исследования, токсический компонент имеет форму длинного двойного тяжа или цилиндра шириной 9 нм, состоящего из круглых или дископодобных частиц диаметром 4,5 нм, расположенных попарно. В отличие от токсина, частицы гемагглютинина, имеющие диаметр 9 нм, собраны в регулярную спираль с поперечным сечением 20 нм. Внутреннее пространство спирали имеет 9 нм. Внутри спирали и помещается тяж токсического белка, если изучению подвергается кристаллический препарат токсина, в котором токсический компонент и гемагглютинин находятся в ассоциированном состоянии (рис. 7). С ботулиническим токсином типа В находится в ассоциации обычно два вида нетоксических компонентов, различающихся между собой по молекулярному весу. Один нетоксический компонент имеет молекулярный вес 150 000,

другой – 350 000 дальтон. Наличие двух форм нетоксического компонента, ассоциирующихся с токсином типа В предполагает существование иммунологических различий у препаратов токсина типа В, полученных от протеолитических и не протеолитических штаммов C. botulinum.

Нетоксический компонент, образующий комплекс с токсином типа Е, имеет молекулярный вес 150 000. Гемагглютинирующими свойствами он не обладает.

Итак, способность образовывать комплексы с определёнными нетоксическими белками является одной из характерных особенностей ботулинических токсинов всех типов.

Синтезируется ботулинический токсин микробной клеткой, видимо, в форме протоксина, который вступает в ассоциацию с нетоксическими компонентами. Образуются ли эти комплексы на стадии неактивированного протоксина, и затем активации подвергается комплекс в целом или с нетоксическим компонентом соединяется активированный токсин – вопрос остаётся открытым.

Активация протоксинов осуществляется соответствующими протеолитическими ферментами. Если токсин продуцируется протеолитическим штаммом (культуры типа А – все протеолитические, а типа В – лишь некоторые), то предшественник токсина активируется собственными эндогенными энзимами. Если же культура непротеолитическая, что относится ко всем штаммам типа Е, то для активации предшественника токсина требуется обработка его трипсином или трипсиноподобными ферментами.

Как установлено для токсина типа Е, предшественник или << протоксин >> имеет единую полипептидную цепь, которая в результате протеолиза фрагментируется с образованием двух пептидов. Разрывается, как минимум, одна пептидная связь, находящаяся между остатками цистина, образующими дисульфидный мостик. Обработка высоко очищенного предшественника токсина типа Е протеиназой, полученной из протеолитической культуры типа В, оказывала меньший активирующий эффект, чем воздействие трипсином. Следовательно, для активации протоксина может иметь значение субстратная специфичность протеиназы. Вторичная обработка трипсином частично активированного предшественника приводит к значительному повышению активности, что указывает на расщепление белковой молекулы не по одной пептидной связи, а – по двум или больше.

Протоксин C. botulinum, подвергнутый протеолизу, приобретает все свойства, характерные для ботулинических нейротоксинов. Биологическая активность активированных токсинов исчезает практически полностью после воздействия на них таким агентом, восстанавливающим сульфидные группы, как дитиотритол или - меркаптоэтанол. Приведённый факт указывает на то, что между пептидами, образовавшимися после протеолиза, существует один или несколько дисульфидных мостиков, наличие которых является решающим условием в проявлении токсином его специфической активности. Разрыв дисульфидных связей, по-видимому, приводит к изменению конфигурации активированного белка и как следствие – к потере активности. Дисульфидные группы токсина имеют, видимо, важное значение и для сохранения его антигенных свойств. Уровень защитного иммунитета, созданного анатоксином, предварительно подвергнутым тиолированию, значительно ниже, чем после иммунизации животных не восстановленным токсином.

В последнее время всё больше появляется экспериментальных данных, позволяющих связать продукцию с инфицированием бактериальной клетки специфическими бактериофагами. Подобно возбудителю дифтерии, явление фаговой конверсии было открыто и у возбудителя ботулизма. Значение фаговой конверсии для токсигенности С. botulinum впервые было установлено на токсинах типа С и D. Заражение конвертирующим фагом того или иного типа С. botulinum зависит от структуры рецептора, расположенного на поверхности бактериальной клетки.

Осуществление контроля за биосинтезом токсина со стороны генома фага наглядно демонстрируется тем, что инфицирование бактериальной клетки фаговым мутантом, утратившим ген токсигенности, не сопровождается продукцией токсина. Показано, что ген, контролирующий продукцию токсина, не интегрируется с клеточной хромосомой. Помимо типов С и D, явление фаговой конверсии для другиех типов ботулинических токсинов не показано.

Несмотря на общность биологического действия, по своей антигенной специфичности ботулинические токсины разделены на ряд типов, обозначенных буквами латинского алфавита ( А, В, С, D, E, F и т. д. ). Имеется достаточно значительное число литературных источников, касающихся антигенных и иммуногенных свойств ботулинических токсинов. При этом, изучение проводилось на препаратах токсинов, обезвреженных действием формальдегида. На модели ботулинических токсинов типов А и Е, полученных в виде индивидуальных компонентов и обезвреженных формалином, показано, что антитела к этим препаратам защищают животных от заражения культурой С. botulinum только гомологичного серотипа.

Структура антигенных детерминант ботулинических токсинов не изучена. Известно лишь, что дисульфидные группировки играют важную роль в проявлении токсинами их иммуногенных свойств. Восстановление дисульфидных групп меркаптоэтанолом приводит к тому, что иммунизация такими препаратами не создаёт защитного иммунитета у привитых животных. Надо надеяться, что характеристика структуры антигенных детерминант будет появляться по мере расшифровки структуры молекулы токсинов в целом.

Независимо от серологического типа все ботулинические токсины относятся к группе нейротоксинов. В отличие столбнячного нейротоксина ботулинические токсины поражают, в основном, периферическую нервную систему. К ботулиническому токсину чувствительны все виды домашних животных, а из лабораторных – наиболее чувствительны морские свинки и кролики.

Опыты с ганглиозидами мозга показали, что трисиалоганглиозид G₁ (G_T1) как отдельно, так и в смеси с другими ганглиозидами инактивирует ботулинические токсины типов А, В, D, E. Введение мышам 0,1 мл смеси, состоящей из 10³ DLM токсина/мл и 100 мкг/мл ганглиозида, не вызывало гибели животных. Инактивация токсина ганглиозидом происходила довольно быстро ( менее чем за 5 мин ) в широком диапазоне температуры (от 2 до 40 ⁰С).

Сфинголипиды, стероиды, а также жирные кислоты (пальмитиновая и стеариновая), фосфолипиды и простогландин Е не оказывали ингибирующего действия на ботулинические токсины.

Предполагается, что молекулы ботулинических токсинов с их выраженными полярными свойствами взаимодействуют с рецепторами, в структуру которых входят сиаловые кислоты, обладающие высоким отрицательным зарядом. Воздействие на трисиалоганглиозид G₁ нейраминидазой снижает степень связывания ганглиозида с токсином. Ганглиозиды, лишённые остатков сиаловой кислоты, не обнаруживают токсинсвязывающей способности вообще.

При экспериментальном ботулизме паралитический синдром возникает в результате избирательного поражения моторных нейронов передних рогов спинного мозга. Помимо специфического действия, лежащего в основе патологического синдрома, характерного для ботулизма, у ботулинических токсинов обнаружена способность воздействовать на фагоцитарный процесс. Токсин не влияет на способность фагоцитов захватывать споры С. botulinum, однако токсин влияет на бактерицидные свойства лейкоцитов. При этом подавление бактерицидного действия лейкоцитов наблюдается спустя приблизительно 8 ч, когда споры прорастают и переходят в вегетативную форму. Таким образом, захват спор лейкоцитами обеспечивает возбудителю жизнедеятельность в условиях макроорганизма, а последующее ингибирование токсином способности переваривать вегетативные клетки создаёт условия для развития бактерий.

Экзотоксины C. tetani

Столбнячный нейротоксин (тетаноспазмин), подобно дифтерийному и ботулиническому токсинам, можно отнести к группе простых токсинов. Существует в виде двух форм – клеточной и внеклеточной. По целому ряду параметров клеточная и внеклеточная формы столбнячного токсина обнаруживают идентичность. В молекуле того и другого токсина обнаружено шесть сульфгидридных группировок и две дисульфидные связи. В молекуле обоих токсинов преобладают дикарбоновые кислоты, аспарагиновая и глутаминовая, а также изолейцин и лизин. Тирозин, триптофан, гистидин и фенилаланин являются теми аминокислотами, которые либо входят в структуру детерминант, определяющих активность столбнячного токсина, либо придают такую конформацию молекуле, которая необходима для реализации её токсического действия.

Молекулярный вес столбнячного токсина, по данным различных авторов, колеблется от 68 000 до 176 000 дальтон. Сходная токсическая активность препаратов, характеризующихся константой седиментации, равной 7,1, а также константой, имеющей почти в 2 раза меньшую величину— 4,5 S и 3,9 S, позволила сделать предположение о повышенной способности столбнячного токсина к агрегации и существовании его в составе агрегатов различной величины. В то же время получение токсина в гомогенном состоянии, свободном от примесей других белков, указывает на то, что биологически активная форма токсина может существовать и вне агрегатов.

В отличие от внеклеточной формы токсина, белок, извлечённый из клеток C. tetani, состоит из одной полипептидной цепи. Воздействие на клеточный токсин дитиотриетолом и додецилсульфатом Na не приводит к фрагментированию полипептидной цепи. Однако если такой обработке предшествует протеолиз трипсином, то полипептидная цепь клеточного токсина распадается на два фрагмента А и В. Образовавшиеся два полипептида остаются соединёнными дисульфидными мостиками и в таком виде существуют как внеклеточная форма токсина.

Говоря о протеолизе, необходимо заметить, что расщепление полипептидной цепи интактного токсина осуществляется, видимо, специфическими протеазами типа трипсина. Действие же такой протеазы, как папаин, приводит к более грубой деградации белка, в результате чего образуются атоксические фрагменты с молекулярным весом 40 000 дальтон.

Воздействие на столбнячный токсин (как клеточный, так и внеклеточный) сульфатом меди приводит к снижению токсичности приблизительно в 1000 раз. При этом происходит расщепление токсина на три фрагмента. ЭДТА и глицин препятствуют расщеплению токсина под действием CuSO₄, что свидетельствует об участии ионов тяжёлых металлов в разрыве дисульфидных связей, соединяющих отдельные участки пептидной цепи.

Изучение антигенной структуры столбнячного токсина позволило обнаружить в нём четыре группы антигенных детерминант. При замораживании до -20 ^оС и хранении в таком виде в течение четырёх суток токсин расщепляется на две самостоятельные антигенные единицы. В этих условиях теряется большая часть токсической активности и снижается флоккулирующая способность токсина.

Антигенные детерминанты анатоксина и токсина, видимо, совпадают, о чём свидетельствуют опыты по иммунизации чувствительных и нечувствительных к токсину животных (птиц). Иммунохимический анализ, проведённый с полученными антисыворотками, показал серологическое родство антител, продуцируемых под действием как токсина, так и анатоксина. Структура и локализация антигенных детерминант, определяющих специфичность столбнячного токсина, остаётся неизученной.

Известно, что столбнячный токсин обладает нейротропным действием. Для развития характерных симптомов столбняка необходимо, чтобы токсин проник в центральную нервную систему, где он тормозит ингибирование синаптических импульсов на спинномозговых моторных нейронах.

Рецепторами для столбнячного токсина служат ганглиозиды— соединения, которыми очень богата нервная ткань. В нервной ткани известно три вида ганглиозидов, различающихся между собой по содержанию в них остатков сиаловой кислоты и характеру их связи с другими компонентами.

Смесь ганглиозида и столбнячного токсина в молярном соотношении 4_*10⁵:1 не снижает токсической активности белка. Смешивание ганглиозидов и токсина в молярном соотношении 3_*10⁹:1 приводит к утрате токсином его биологических свойств. Ганглиозид при этом не претерпевает изменений.

Альфа-токсин (альфа-гемолизин) S. aureus

Стафилококковый альфа-токсин представляет собой простой белок. Среди аминокислот преобладают аспарагиновая кислота, лизин и треонин. Альфа-токсин чувствителен к нагреванию. Под действием трипсина альфа-токсин расщепляется на два фрагмента: фрагмент А и фрагмент В. Фрагмент А обладает летальным действием, которое сохраняется после повторной обработки фрагмента трипсином. Этот факт позволяет рассматривать летальный фрагмент А стафилококкового токсина как устойчивый к протеолизу пептид. В противоположность фрагменту А, фрагмент В токсина легко агрегируются и в результате протеолиза деградирует.

В интактном состоянии стафилококковый альфа-токсин не обладает каким-либо видом протеолитической активности. Однако после взаимодействия альфа-токсина с эритроцитами он приобретает протеолитические свойства.

Альфа-токсин по антигенным свойствам представляет собой видоспецифический белок патогенных стафилококков. Антигенная специфичность альфа-токсина является одним из критериев для выделения его из группы других гемолизинов, продуцируемых этими микроорганизмами. Гемолизины альфа, бета, дельта, гамма и эпсилон по характеру антигенной специфичности не идентичны между собой.

Поскольку альфа-токсину придается большое значение как фактору патогенности стафилококков, то соответственно и антитоксическим антителам отводится важная роль в создании антистафилококкового иммунитета. В качестве прививочного препарата обычно используют вакцины на основе альфа-токсина, обезвреженного формалином. Такой анатоксин обладает высокой иммуногенностью для мышей. Двукратная вакцинация мышей очищенным сорбированным стафилококковым анатоксином создает у животных иммунитет к последующему внутрибрюшинному заражению патогенными стафилококками.

Стафилококковый альфа-токсин обладает несколькими видами биологической активности: летальной, дермонекротической и цитотоксической.

Способность альфа-токсина вызывать лизис эритроцитов позволяет рассматривать его как классический гемолизин. К гемолитическому действию

Летальная доза (LD₅₀) стафилококкового альфа-токсина для мышей при внутрибрюшинном заражении составляет 27-34 мкг на 1 кг веса животного, минимальная летальная доза для кроликов при внутривенной инъекции равна 1,3 мкг/кг. В эксперименте на кроликах показано, что минимальная дермонекротическая доза альфа-токсина характеризуется величиной 0,03 мкг. Смерть наступает в течение нескольких минут при введении кроликам внутривенно большой дозы альфа-токсина. При этом отмечается паралич респираторного центра и возникновение мышечных спазмов.

Стафилококковый альфа-токсин вызывает нарушение периферического кровообращения, а также действует на сердце и центральную нервную систему. Альфа-токсин обусловливает сужение коронарных артерий и систолитическое торможение.

Помимо микроорганизмов, токсическое действие альфа-токсина установлено на целом ряде тканевых культур. Альфа-токсин индуцирует бласттрансформацию в культуре кроличьих лимфоцитов. В опытах с частично очищенными препаратами показано, что альфа-токсин ингибирует транспорт ионов.

Энтеротоксины стафилококков

Стафилококковые энтеротоксины относятся к группе простых токсинов. Известно несколько серологически различных типов стафилококковых энтеротоксинов, обозначенных соответственно буквами латинского алфавита от А до F. Независимо от типа все стафилококковые энтеротоксины обладают сходными биологическим действием, что указывает на общность отдельных участков их структуры. В тоже время различие по антигенным детерминантам свидетельствует об отсутствии полной идентичности их молекулярного строения.

Молекулярный вес стафилококковых энтеротоксинов колеблется в пределах 30000 дальтон и зависит, видимо, от метода выделения и очистки, а также от способа определения молекулярного веса. В полипептидной цепи стафилококковых энтеротоксинов преобладают лизин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, содержатся только два полуцистиновых остатка и один или два остатка триптофана.

Все стафилококковые энтеротоксины в нативном состоянии устойчивы к действию протеолитических ферментов, таких как трипсин, папаин, химотрипсин и ренин. Пепсин инактивирует стафилококковые энтеротоксины при рН около 2,0.

Стафилококковые энтеротоксины отличаются термоустойчивостью, однако чувствительность их к температурному воздействию связана со степенью очистки токсина, величиной рН и ионной силы. Антигенные и токсические сайты по-разному реагируют на воздействие высоких температур, что подтверждает их различную локализацию в белковой молекуле токсина.

По своей антигенной специфичности стафилококковые энтеротоксины делятся на ряд типов. К каждому из серологических типов можно получить гомологичные антитела, однако наряду с этим, в сыворотке, как правило, обнаруживаются гетерологичные антитела, свидетельствующие об общности некоторых антигенных детерминант у токсинов различных серотипов. Серологическими методами было установлено антигенное родство между энтеротоксинами типов А – Е и В – С. Эти типы токсинов сходны между собой не только в антигенном отношении, но и по аминокислотному составу.

Подобно другим бактериальным токсинам, стафилококковые энтеротоксины утрачивают специфическую биологическую активность под действием формалина (0,7 %), сохраняя при этом свои антигенные свойства. Так может быть получен анатоксин, пригодный впоследствии для иммунизации.

По сравнению с другими белковыми токсинами стафилококковые энтеротоксины являются слабыми антигенами. Именно по этой причине используются напряженные схемы иммунизации, так как только такой подход позволяет получать антисыворотки к указанным токсинам с более или менее высоким титром специфических антител.

После иммунизации кроликов “гретым” препаратом токсинов в крови животных появляются преципитирующие антитела, выявляемые в реакции диффузии в агаровом геле.

Преципитация стафилококковых энтеротоксинов с гомологичными антителами широко используется для диагностики пищевых интоксикаций, а также для выявления зараженности пищевых продуктов стафилококками.

Для биологической активности стафилококковых энтеротоксинов характерен, в основном, энтеротоксический эффект. В лабораторных условиях энтеротоксическую активность стафилококковых энтеротоксинов устанавливают в опытах на обезьянах и кошках.

Данные о механизме действия стафилококковых энтеротоксинов весьма ограничены. В отличие от холерного экзоэнтеротоксина, действующего на аденилциклазную систему, нарушение какого-либо конкретного биохимического процесса, свойственное стафилококковым энтеротоксинам, не установлено, В опытах in vitro на митохондриях печени кроликов показано, что действие стафилококковых энтеротоксинов типа В приводит к нарушению обмена аденоцинтрифосфата и ионов Mg²⁺. В связи с этим предполагается, что в основе клинической картины, вызываемой стафилококковыми энтеротоксинами, лежит поражение функций митохондрий отдельных чувствительных тканей.

Стафилококковый энтеротоксин типа В индуцирует митоз лимфоцитов, вызывает генерализованный хемотаксис нейтрофилов, ингибирует миграцию макрофагов, вызывает цитотоксический эффект тканевых культур. Каждый из указанных видов воздействия можно нейтрализовать специфической антитоксической сывороткой.

При введении стафилококкового энтеротоксина типа В в кровяное русло до 15 – 20 % его обнаруживается в лейкоцитах, остальная часть содержится в альбуминовой фракции сыворотки. Лейкоциты, содержащие энтеротоксин, локализуются, в основном, в легочной ткани.

Патологоанатомическое исследование желудочно-кишечного тракта свидетельствует о том, что стафилококковые энтеротоксины вызывают поражение слизистой, а именно: гиперемию, регионарные отеки, разрушение ворсинок, эрозию, расширение лимфатических сосудов. Описан пирогенный эффект, вызываемый введением очищенных препаратов стафилококковых энтеротоксинов типов А и В.

Действие стафилококковых энтеротоксинов на рвотный центр, находящийся в IV желудочке продолговатого мозга, происходит опосредовано через симпатическую и парасимпатическую нервную систему. Через парасимпатическую нервную систему действие токсина, по-видимому, распространяется на рвотный центр при введении его per os. При внутривенном введении энтеротоксина действие его на рвотный центр осуществляется через симпатическую нервную систему. Для защиты животных от биологического действия токсина необходимо блокировать оба звена.

Энтеротоксин C. perfringens

По химической природе энтеротоксин C. perfringens является простым белком. Токсин продуцируется в период споруляции микроорганизма, спустя 3 – 5 часов с момента внесения вегетативных клеток в среду, содержащую мясной бульон, и может быть извлечён лишь после лизиса спорангиума. Вегетативные клетки не вырабатывают токсин. Установлено, что токсический белок является структурным компонентом оболочки споры, и его биосинтез коррелирует с процессом спорообразования. На мутантах C. perfrigens типа А, различающихся между собой по способности образовывать споры, показано, что биосинтез энтеротоксина осуществляется, видимо, под контролем того же гена, который регулирует и спорообразование у этого микроорганизма. Однако какова функция токсического белка в спорообразовании C. perfrigens, – вопрос остаётся невыясненным.

Наиболее интенсивное спорообразование и продукция энтеротоксина наблюдается при рН 8,0 – 8,5 и температуре 37°. Повышение или снижение температуры, так же как и закисление среды, неблагоприятно сказывается на споруляции и спорообразовании.

Для выделения энтеротоксина споры дезинтегрируют, например с помощью ультразвука, после чего токсин извлекают каким-либо из препаративных приёмов.

Молекулярный вес энтеротоксина C. perfrigens точно не установлен и колеблется от 33 000 до 40 000. Считается, что токсин находится в нескольких молекулярных формах, характеризующихся не только величиной молекулы, но и различной изоэлектрической точкой. Каждая из этих форм обладает специфической биологической активностью.

Белок энтеротоксина разрушается под действием проназы и протеиназы B. subtilis, но устойчив к действию ряда ферментов, например, трипсина,и папаина. Энтеротоксин хорошо растворяется в воде и солевых растворах. Токсический белок чувствителен к нагреванию: при температуре 60° он сохраняет свою активность лишь в течение 4 мин.

Энтеротоксин C. perfrigens обладает выраженными антигенными свойствами. При введении его кроликам в крови последних накапливаются антитела, обладающие способностью нейтрализовать биологическое действие энтеротоксина. Антигенная специфичность энтеротоксина C. perfrigens не совпадает со специфичностью других токсинов, вырабатываемых этим же микроорганизмом. Антитела к другим токсинам, присутствующим в диагностических сыворотках к C. perfrigens типов А, В, С, D и Е, не оказывали нейтрализующего эффекта на энтеротоксин.

На основании испытаний энтеротоксина C. perfrigens в эксперименте на животных считают, что ему свойственны 2 вида биологической активности: способность вызывать диарею и летальная.

Развитие диареи является основным показателем специфического действия энтеротоксина. Эти симптомы были установлены на обезьянах и волонтёрах, а в опытах на легированной кишке кролика и ягнёнка было показано, что способность вызывать диарею коррелирует со свойством стимулировать накопление жидкости в кишечной петле.

О летальном действии энтеротоксина судят по испытанию его на мышах. Внутривенное введение энтеротоксина C. perfrigens мышам вызывает гибель их спустя 20 – 30 мин. после инъекции. Замечено, что если мыши не гибнут в течение этого времени, то в дальнейшем энтеротоксин уже не оказывает на них летального действия.

Изучение механизма действия энтеротоксина Cl. perfrigens показало, что накоплению в кишечнике жидкости и диаррее предшествует резкое повышение

капиллярной проницаемости и увеличение просвета сосудов кишечника. Морфологические изменения, связанные с некротизированием слизистой ткани кишечника, отсутствуют. Установлено, что энтеротоксин вызывает изменение транспорта воды, натрия и хлоридов. Значительно ингибируется адсорбция глюкозы под действием токсина, в то же время транспорт калия и бикарбоната практически остаётся неизменным.

Альфа-токсин (фосфолипаза С) C. perfringeus типа А

Альфа-токсин C. perfringeus представляет собой белок, обладающий ферментативными свойствами с молекулярным весом в пределах 50 000 дальтон.

В составе альфа-токсина C. perfringens найдено 17 аминокислот, из которых количественно преобладали глутаминовая и аспарагиновая кислоты, а также лизин; среди аминокислот отсутствовал метионин. В энзиматически активном состоянии альфа-токсин содержит цинк, который помимо активирующей роли придает молекуле токсина еще и значительную стабильность. В опытах по выявлению роли цинка в ферментативной активности альфа-токсина было установлено, что бактерии продуцирует токсин в виде неактивного белка, и только после соединения с металлом этот белок приобретает свойственную ему специфическую активность.

Под действием термической обработки альфа-токсин теряет лишь часть своей фосфолипазной активности. После нагревания при 100 ⁰С в течение 10-15 мин фосфолипазная активность токсина сохраняется приблизительно на 45 %.

Антитела к альфа-токсину являются основой защитного иммунитета при газовой гангрене.

Говорить о биологическом действии альфа-токсина несколько затруднительно, так как даже высоко очищенные препараты токсина содержат такие примеси, как гемолизин, протеазу, дезоксирибонуклеазу, фосфатазу, сульфатазу и др. Считается, что основу действия альфа-токсина составляют ферментативные процессы, катализирующие гидролитическое расщепление липопротеинов, входящих в состав биологических мембран. Нарушение структуры и функции мембран приводит к изменению клеточной проницаемости, деструкции клеток и возникновению отека. Формирование отека сопровождается снижением окислительно-восстановительного потенциала в прилегающих тканях, активацией эндогенных протеиназ и как результат— автолизом пораженной ткани.

Гистохимические исследования, проведенные с высокоочищенным препаратом альфа-токсина, показали, что внутримышечное введение его морским свинкам вызывало жировую дистрофию мышц, разрушение миелина нервов и цитоплазматических оболочек жировых клеток, жировую декомпозицию оболочек эритроцитов и липемию. Коллагеновые, ретикулярные и эластические волокна были относительно устойчивы к альфа-токсину. Гликоген в зоне первоначального некроза сохранялся в течение 40 мин. без изменений.