2.2.6 Тығыз қоректену ортасына (Кохтың табақшалық әдісі) егілетін жасушалар мөлшерін анықтау

Әдіс мұнай сорбентінде өмір сүре алатын жасушалардың санын анықтау үшін қолданылады. Алдын ала иммобилизациаланған микроогранизмдері бар 1г адсорбентке 1 мл стериленген құбырлық су құйылды. Содан соң, зерттеу жүргізіліп жатқан микроорганизмнің суспензиясының белгіленген көлемі тығыз орта Петри табақшаларына себілді және өсіп шыққан колониялар саналды. Әр колония баған бір жасушаның ұрпағы деп санау қабылданған.

Бұл әдіспен жұмыс үш сатыдан тұрады [33]:

- Ерітінді дайындау;

- Тығыз орта Петри табақшаларына егістік ;

- Өсіп шыққан колонияларды санау.

Ертінділерді дайындау. Әдетте микроорганизмдердің популяция саны өте үлкен, сондықтан оқшауланған колонияларды алу үшін тізбекті ерітінділердің қатарын дайындау қажет. Ерітінділерді өсіру құбыр суында жүргізілді және өсіру коэффиценті ретінде 10 алынды. Ерітінділерді дайындау үшін шыны түтіктерге 9мл-ден құбыр суы құйылды. Содан кейін, шыны түтіктерді 120С және 1 атм-да автоклавта стерилденді. Кейін зерттеу жүргізіліп жатқан адсорбенттің 1 мл-н стерилді пипеткамен 9 мл стерилденген суы бар шыны түтікке құйылды – бұл 1-ші ертінді, 10^-1. Пайда болған ерітінді жаңа пипеткаға қоспаны алып шығару арқылы стерильді пипеткамен мұқият арастырылды. Бұл процедура 3-5 рет орындалды, кейін сол пипеткамен алынған суспензияның 1мл таңдалып, оны екінші пробиркаға көшірілді‑ бұл 2-ші ерітінді, 10^-2. Келесі ерітінділер де осы әдіспен дайындалды. Ерітінді дәрежесі зерттелетін микроорганизмдердің популяциясының тығыздығына тәуелді; сәйкесінше популяцияның тығыздығы көп болған сайын ерітінді дәрежесі де үлкен болады.

Егісті жүргізу. Егіс алдында беттік әдіспен әрбір стерильді Петри кеселеріне 15-20 мл-ден агарланған ішуге жарамды суды (500 мл. суға 17,5 г. шабақты агар (килькового агара), 10 г. агар-агар) құйылды. Қоректі ортаны 30 минут бойы Р =1 атм, 120С-та автоклавтау арқылы стирилденді. Бұл әдіс субстратты атмосфералық қысымы жоғары қаныққан бумен қыздыруға негізделген, мұнда жоғарғы температура мен бу стерилдеудің сенімділігін қамтамасыз етеді: автоклавтау кезінде вегативті жасушалар да, микроорганизмдердің споралары да өледі. Шыны ыдыс стирилденуін 2 сағат бойы 165С-та кептіргіш шкафта жүргізді. Орта суымағанша кеселер горизонтальді бетте қалдырылды. Орта дайын болған соң, оның бетіне стерильді пипеткамен сәйкес ерітіндінің өлшенген көлемі (0,05 мл.) жағылды және ол стерильді шпательмен су бетіне таратылды. Тығыз ортаға егіс соңғы үш ерітінді арқылы жүргізілді және әрбір ерітіндіден үш параллельді егіс жасалды.

Өсіп шыққан колонияларды санау. Бактериялар колониясы термостаттағы екі күндік инкубациядан кейін саналды. Санау петри кеселерін ашпай жүргізілді. Санауға ыңғайлылы болу үшін Петри кесесінің сыртына саналған колония бойына маркермен нүкте қойылды. Колониялар көп болған жағдайда кесе түбін төрт секторға бөліп, әр сектордағы колонияларды санап, кейін қосты. Бір ертіндінің параллельді егістер нәтижелері қосылып, бір кеседе берілген ертіндіден өсіп шыққан колониялардың орташа саны анықталды.

Зеріттеудегі субстраттың 1 мл-дегі жасушалар саны 6-теңдеу арқылы есептелді [33]:

A10^N

N= -------------, (6)

V

мұнда N –1 мл-дегі жасушалар саны.;

A – берілген ертінді еккендегі өсіп шыққан колониялардың орташа саны;

N – егіс жасалған ерітіндінің реттік номірі;

N – егіс үшін алынған суспензия көлемі, V=0,05 мл.