12. Понятие о флуоресцентной in situ гибридизации (fish).

1986 год. Метод определяет положение и типы ДНК непосредственно в местах их локализации в клетке или на хромосоме. Основа метода – наборы молекулярных зондов однонитчатой ДНК, способных избирательно гибридизировать со специально образующимися хромосомами. В результате – диссоциация нитей, зонты садятся на свои учатски и маркированы красителями. Таким образом происходит окраска последовательно ДНК, комплиментарным зондом.

Методика

1.приготовление зондов

2. зонды гибридизируют с комплиментарными участками ДНК и позволяют видеть локализацию генов в составе ДНК или хромосом.

приготавливают препараты интерфазных ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70°

Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

13. Этапы fish

1. получение препаратов и их подготовка

2. мечение ДНК-пробы

3. гибридизация с ДНК-пробой

4.детекция ДНК-зонда

1)обработка РНКазой и пепсином, формамид, разрушение водородных связей и в результате получают одноцепочечные ДНК

2) денатурация ДНК-проб около 5 мин при 100градусахС,

3) гибридизация 20 часов

14. Микродиссекция

Микродиссекция, микропрепаровка - процесс разделения мелких структур при их микроскопическом изучении. С помощью миниатюрных хирургических инструментов, например, стеклянных скальпелей, выполняются различные перемещения механических соединений, благодаря чему уменьшается относительная неточность движений рук оператора во время осуществления им микродвижений. Таким образом обеспечивается возможность рассечения клеточных ядер и даже отдельных хромосом

Лазерная захватывающая микродиссекция — метод изоляции отдельных клеток с необходимыми характеристиками из биологических образцов ткани, позволяющий избежать возможных повреждений или изменений клетки либо минимизировать их. Прозрачная плёнка накладывается на образец, затем нужные клетки идентифицируются под микроскопом. Под воздействием лазерного луча клетки слипаются с плёнкой и вместе с ней вынимаются из образца для дальнейшего исследования. ЛЗМ позволяет избежать повреждений морфологии клетки и её химического состава, что делает этот метод оптимальным при изучении ДНК, РНК, белкового состава клетки. Среди возможных образцов — мазки крови, цитологические препараты, культуры клеток, и даже замороженные и парафинированные образцы

16. M-FISH (Multicolor или Multiplex FISH) является общим названием традиционных многоцветных FISH-методов с использованием комплектов флуорофор-специфичных фильтров. Принцип M-FISH заключается в раздельной цифровой регистрации сигнала всех используемых флуорофоров при последовательной смене комплектов фильтров. Обработка записанной информации, связанной с разделением сигнала и фона, а также с количественной оценкой сигнала, производится с помощью специального программного обеспечения, которое переводит информацию об уровне сигналов флуорофоров в каждой точке изображения в псевдоцвета. Одним из основных ограничений количества используемых ДНК-зондов является число доступных флуорофоров с неперекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии и наличие соответствующих комплектов фильтров.

Наиболее широкое распространение получил такой вариант M-FISH, как 24-цветный FISH, предназначенный для одновременной идентификации материала всех хромосом человека. Данный метод обладает высокой эффективностью при выявления хромосомных транслокаций, поскольку каждая пара хромосом окрашена в свой псевдоцвет, но не позволяет выявлять делеции и инверсии.