4 Мікробіологічні основи виробництва лізину
Схема виробництва лізина хіміко-ферментативним способом включає використання двох ферментів - L-гідролази і рацемази. L-гідролаза гідролізує D, L-а-аміно-ε-капролактам, що отримується в процесі органічного синтезу, рацемаза здійснює рацемізацію L-гідролазою D-форми в L-форму. Гідролазу L-а-аміно-ε-капролактаму звичайно продукують штами дріжджів родів Candida, Cryptococcus. Рацемазу D-а-аміно-ε-капролактаму отримують при культивуванні бактерій родів Achrobacter, Flavobacterium.
Спільний вплив обох ферментів на субстрат L, D-а-аміно-ε-капролактам раціонально проводити в апараті періодичної дії, що містить продуцент ферментів.
Candida albicans – активний продуцент ферментів L-гідролази і рацемази, необхідних для біотрасформації хімічних попередників лізину. Здатність даних дріжджів до біосинтезу обох ферментів викликана спрямованою модифікацією їхнього геному генно-інженерними маніпуляціями.
Додатковою перевагою використання Candida albicans у виробництві лізину є невибагливість до поживних речовин, високі продуктивність і швидкість росту [10].
4.1 Морфологічні властивості дріжджів роду Candida
Для характеристик дріжджових грибів зазвичай використовують макро- і мікроморфологічні ознаки, тому що першими вивчають візуально культуральні ознаки, а другі - за допомогою мікроскопа.
Для макроморфології виділення чистої культури проводять на щільних середовищах Сабуро, сусло-агарі, Кандіда-агарі, хромогенному Кандіда-агарі, хламідоспор-агарі, агарі Нікерсона. Для придушення зростання супутніх бактерій до цих середовищ додають пеніцилін, стрептоміцин або інші антибіотики. Колонії Candida через 2-3 доби мають середні розміри, білувато-жовтий колір і матову поверхню, у міру росту вони набувають перламутровий відтінок і у них з'являється куполоподібні піднесення.
На Кандіда-агарі гриби роду Candida утворюють щільні, сметаноподібної консистенції білі або сіро-кремові колонії розміром 1 - 3 мм.
На хламідоспор-агарі на поживному середовищі по краям ліній посіву виявляються специфічні утворення - хламідоспори, які диференціюються від дріжджових клітин правильно-округлою формою, двоконтурною оболонкою та зернистістю в центрі [11].
Більш селективним є вирощування на хромогенному Кандіда-агарі, C. albicans утворюють гладкі зелені колонії.
На агарі Нікерсона колонії C. albicans гладкі, круглі, без блиску, коричнево-чорні.
На середовищах, що містять залізо C. albicans утворюють темно-червоні колонії.
На агарі Сабурочерез 24 - 48 год. культивування колонії C. albicans білі,круглі. На рисунку 4.2 зображено колонії C. albicans на агарі Сабуро.
Рисунок 4.2 – Колонії C. albicans на агарі Сабуро
Найбільшу кількість клітин виявляють у середовищах Сабуро та Кандіда-агарі, але переважно використовують перше через його значно меншу вартість [12].
У мікроморфологіїдля деяких дріжджів форма клітин настільки характерна, що може бути використана для встановлення їх родової належності.Клітини дріжджів роду Candida зазвичай мають круглу, сферичну, овальну, яйцеподібну, рідше циліндричну, іноді неправильну форму, але їх морфологія непостійна, вона змінюється залежно від складу середовища та умов культивування, тому не може використовуватись як таксономічна ознака.
Розмір молодих клітин коливається від 0,5 до 5 мкм в діаметрі, зрілих 6 - 10 мкм.
Характерна рухомість протоплазми і нездатність до активного переміщення, апікальний ріст.
Клітини мікроорганізмів роду Candida - це типові еукаріотичні клітини, які складаються з клітинної стінки, цитоплазми з цитоплазматичною мембраною та органелами (ендоплазматичний ретикулум, лізосоми, мікротільця, мітохондрії, рибосоми, включення, вакуолі, ядро). Ядро чітко відособлене і оточене мембраною.
Клітина відділена від зовнішнього середовища клітинною стінкою завтовшки 70 - 350 нм. Основним компонентом клітинної стінки є полісахариди. Крім полісахаридів, у складі клітинної стінки виявлено білки, ліпіди та неорганічні поліфосфати. Основними структурними одиницями полісахаридів є переважно глюкоза і маноза. До складу клітинної стінки входить також амінополісахарид хітин.
Цитоплазматична мембрана складається з подвійного шару ліпідів, який міститься між тонкими шарами білка. Білкові молекули розміщуються не тільки на поверхні мембрани, а й пронизують її наскрізь.
Ядро оточене ядерною мембраною. Носієм генетичної інформації є ДНК, розподілена між хромосомами.
Ядро є основним, але не єдиним носієм генетичної інформації. Частина такої інформації міститься в ДНК мітохондрій. Мітохондрії - сферичні чи паличкоподібні структури, оточені двошаровою мембраною.
Ендоплазматичний ретикулум являє собою систему мембранних пластин, каналів, бульбашок і цистерн, оточених елементарною мембраною. Функції у дріжджовій клітині: забезпечення внутрішньоклітинного транспорту поживних речовин, участь в обміні вуглеводів, синтезі ліпідів та інших важливих метаболічних процесах.
Лізосоми - внутрішньоклітинні органели, оточені ліпопротеїдною мембраною. Вони містять набір ферментів, які гідролізують білки, полісахариди та нуклеїнові кислоти.
Зрілі клітини містять велику вакуоль. Функції її точно не встановлені. Ймовірно, що вакуоль діє як резервуар для зберігання поживних речовин і гідролітичних ферментів.
Включення - запасні речовини(глікоген, поліфосфати (волютин), жири у вигляді окремих крапель).
Нейтральні жири (тригліцериди), в особливо великих кількостях відкладаються у вакуолях. Дріжджі роду Candida можуть накопичувати до 80% жирів по відношенню до сухої речовини.
Вміст запасних жирів визначається складом поживного середовища і ці жири можуть бути виділені безпосередньо з клітин. Кількість інших ліпідних сполук від складу середовища майже не залежить. Ці ліпіди звільняються лише після гідролізу білків і полісахаридів і являють собою компоненти ліпопротеїнів, що входять до складу плазматичної мембрани і внутрішніх мембран, і ліпополісахаридів.
Деякі види цих дріжджів можна виділити з нектароносних квіток і з плодів, а також з кишечника бджіл [13].