4. Недоліки плазмідних векторів.

Основним недоліком плазмідних векторів для клонування є їх мала ємність щодо клонуючих фрагментів ДНК. Розмір вставок клонованої ДНК в плазмідних векторах, які здатні стабільно в них існувати, як правило, не перевищує кількох тисяч пар основ. Великі вставки ДНК у векторних плазмідах нестабільні, і їх розміри поступово зменшуються в міру збільшення числа раундів реплікації рекомбінантних плазмід in vivo. Переважне делетирування чужорідної ДНК в плазмідах великого розміру пов'язано з тим, що в бактеріальних клітинах селективну перевагу отримують ті плазміди, час реплікації яких мінімальний. Тому нуклеотидні послідовності ДНК, що не беруть участь у реплікації векторних плазмід, поступово елімінуються за допомогою делецій при тривалому культивуванні рекомбінантних бактерій.

5. Використання плазмідних векторів в генній інженерії

Векторами в генній інженерії служать шіазміди, фаги та косміди. Плазміди бактерій — це позахромосомні молекули ДНК кільцевої форми розміром від 2 до 400 тис. пар нук-леотидів. Характерною їх особливістю єтрапсмІсив-н і с т ь, тобто здатність передаватися від одних бактері­альних клітин до інших (див. Кон'югація). Перенесення плазмід відбувається в природі і в експерименті. Існує два типи плазмід — о д н о к о п і й н і {на клітину припадає 1 молекула плазмідної ДНК) і м у л ь т и к о п і й н і (на одну клітину припадає 10—20 плазмідних геномів). Окремі плазміди, які знаходяться під послабленим контролем реп­лікації, можуть накопичуватися (за умов припинення росту бактерій) у величезних кількостях — до 1 тис. плазмід на одну клітину. Такі плазміди використовуються для клонування векторів, оскільки вони забезпечують високий ви­хід матеріалу.

Останні двадцять років інтенсивно вивчаються і вико­ристовуються плазміди, які зумовлюють стійкість бактерій до антибіотиків (R-плазміди; resistance - стійкість). Вони містять генетичну інформацію, що забезпечує синтез про­дуктів, які подавляють дію антибіотиків.

Плаз­міда з генами стійкості до ампі­циліну і тетрацикліну (Amp^r; Tet^r). Всередині цих генів е ді­лянки дії рсстриктаз. Плазмі да, точніше ген стійкості до анти­біотика, розрізується рестрикта-зою, І в місці розрізу за допо­могою ферментів вмонтовується чужа ДНК, нарізана на фраг­менти цією самою рестриктазою. Розрізаний ген при цьому по­шкоджується, і бактерія з рекомбїнантною плазмідою втрачає стійкість до антибіотика. Зверніть увагу на те, що рестриктази розщеплюють ДНК у тих ділянках, де комплементарні нуклеотиди розміщуються відповідно до осьової симетрії. Місця розщеплення молекули даною рестриктазою вказані пунктирними стрілками. Внаслідок розщеплення утворюються фрагменти з липкими кінцями (ТТАА; ААТТ). Фрагменти різного походження, одержані під впливом однієї рестриктази, мають комплементарні липкі кінці і легко зшиваються між собою в кільцеву струк­туру. Поряд з плазмідною ДНК вона містить ДНК донора. Загальне уявлення про метод одержання рекомбінантних молекул ДНК та введення їх у живі клітини дає рис.  Найчастіше для створення рекомбінантних гібридних молекул використовують плазміди, які мають лише одну ділянку дії для певної рестриктази, тобто ДНК розрізу­ється нею в одному місці. У плазміду можна вставити фраг­мент чужої ДНК розміром не більше 15 тис. пар нуклеоти-дів. З цією метою розрізані певною рестриктазою плазміди і фрагменти ДНК донора змішуються і під дією лігази зшиваються у кільцеву структуру — гібридну плазміду (рекомбінантну ДНК).

Рекомбінантні молекули так само, як і вихідні плазміди, під час введення їх у клітину реплікуються і передаються дочірнім клітинам. Внаслідок трансформації реципієнти! клітини набувають певних ознак донора.

Для одержання рекомбінантних молекул з велики­ми розмірами вставок (до 23 тис. п. н.) як вектор використо­вують ДНК фага К. Вона мае два місця дії рестриктази Р І. Кінцеві ділянки, які відрізуються нею (рис. 104), містять інформацію для розмноження фага. Серединну час­тину Х-фага вирізають і на її місце вставляють фрагмент чужої ДНК, об'єднуючи її з кінцевими ділянками фагової ДНК- Зшивання фрагментів здійснює лігаза. Рекомбі-нантна молекула упаковується в білкову оболонку і утво­рюється зріла фагова частка, яка здатна до розмноження. Фаги, які містять рекомбінантну молекулу ДНК, вводяться в бактерію. Рекомбінантна ДНК інтегрується з бактері­альною хромосомою і реплікується разом з нею. Вмонтова­ний за допомогою фага ген може проявлятися фенотипово.

Для перенесення великих фрагментів ДНК (35-40 тис. п. н.) використовують особливі вектори — косміди. їх одержують об'єднанням невеликих фрагментів фага λ і плазмід. Вони (косміди) містять ділянку фага λ під назвою кос, яка відповідає за упаковку рекомбінантпої ДНК у біл­кову оболонку, а також гени плазмід, відповідальні за їх реплікацію, та геп стійкості до тетрацикліну. За допомогою плазмід, фагів та космід штучно створені гени та фрагменти ДНК донора вводять у бактеріальні клітини І викликають їхню трансформацію.