3. Плазмідні вектори

Вектор – це молекула ДНК, що переносить фрагмент ДНК що клонується. Будь-який вектор повинен забезпечувати стабільне наслідування рекомбінантних ДНК в автономному стані.

Плазміда, що використовується в якості вектора для клонування E. сoli, повинна мати 3 характеристики:

1. Мати сайт ori (ділянка ініціації реплікації) для нормальної реплікації ДНК і розмноження плазміди в клітині E. соli.

2. Домінантний селективний маркер, який дозволяє вибрати клітину, що несе плазміну з включеним фрагментом чужорідної ДНК.

3. Унікальний сайт рестрикції, який зустрічається в векторі один раз.

Широко розповсюджені плазмідні вектори (pBR322 I pUC9) беруть свій початок з невеликої плазміни ColE1, що реплікується в клітинах E. Сoli незалежно від хромосоми. В спеціальних умовах вирощування бактерій можна добитися вибіркової ампліфікації цих плазмід, в результаті чого вони утворюють до 1000 копій на клітину. Плазміда pBR322 має гени стійкості до антибіотиків ампіциліну (Ар) і тетрацикліну (Тс). В гені Тс є унікальний сайт, що розрізається рестриктазою ВаmHI (Рис. 3.1.)

Рис.3.1. Схема вбудовування клонуючих фрагментів ДНК в плазміду pBR322

Після обробки ДНК плазміди рестриктазою ВаmHI получається лінійна ДНК, що має специфічні «липкі кінці». Її змішують з фрагментами клонованої ДНК, яка також оброблена ВаmHI і також має «липкі кінці». Наступна обробка лігазою приводить до створення плазміди, яка містить чужорідну ДНК. Розмір вбудованого фрагмента – 3 -5 т.п.н.

Як і сам процес вбудовування фрагмента в плазміну, так і трансформація плазміди в E. Сoli є процесами статичними, в результаті яких можуть утворитися три типи клітин: ті, що не містять плазміди, містять плізміду без вставки, містять плазміну з вставкою. Щоб вибрати клітини, що несуть плазміди з вбудованими послідовностями ДНК, використовують наступну схему експерименту (рис. 3.2.). Максимальний розмір вставки ДНК складає 10 т.п.н.

Рис. 3.2. Схема виявлення плазмід, що містять вставку.

Часто в дослідах використовують в якості вектора плазміду pBluescriptII KS. Це кільцева молекула, що має довжину 2961 п.н., створена на основі іншої плазміди – pUC19. Плазміда pBluescript характеризується наступними особливостями: (Рис. 3.3.).

Рис. 3.3. Плазміда pBluescriptII

1. Число копій досягає 100 на клітину

2. Селекційним маркером являється ген резистентності до ампіциліну amp

3. Вона містить цілий ряд унікальних сайтів рестрикції, зібраних в одному місці. Такі ділянки називають полілінкерними.

Клітини в яких відбулася трансформація плазмі дою, відбираються по їх життєздатності рости на середовищі з ампіциліном. Ті клітини, що містять плазміди з вбудованою ДНК, створюють не зафарбовані колонії, якщо колонії зафарбовані в синій колір, це значить в цих клітинах плазміда не має вставки.

Бактеріальні штучні хромосоми (ВАС). Ці вектори приготовані на основі плазміди F-фактора у E. сoli.

Ця плазміда (рис. 3.4.) має гени, які не тільки контролюють реплікацію її ДНК, але і число копій в клітині.

Рис. 3.4. Будова плазміди pBAC108L.