27. Методы культивирования вирусов.

1. Культуры клеток.

2. Куриные эмбрионы.

3. Лабораторные животные.

Культуры клеток готовят из тканей животных или человека и раз­деляют их на:

1) первичные или неперевиваемые;

2) полуперевиваемые;

3) перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток состоит из этапов:

1) измельчение ткани;

2) разъединение клеток путем трипсинизации;

3) отмывание однородной суспензии изолированных клеток от трипсина;

4) суспендирование клеток в питательной среде, которая обеспечи­вает их рост;

5) перенос питательной среды и изолированных клеток ткани в спе­циальные сосуды для культивирования.

Клетки начинают развиваться и в дальнейшем приклеиваются к стенкам сосуда, образуя слой на поверхности стекла. Такую культуру также называют однослойной культурой клеток.

После образования сплошного монослоя культура клеток может быть использована для дальнейшего пассирования. При повторном пе ресеве старую среду удаляют, клетки снимают со стекла трипсином, суспендируют в свежей питательной среде и рассевают в новые сте­рильные флаконы. Полученная таким образом культура носит название вторичная или полуперевиваемая культура клеток С помощью спе­циальных методик культивирования получают штаммы диплоидной культуры, клетки которой сохраняют диплоидный набор хромосом на протяжении 50 пассажей. Такая культура называется полуперевиваемой диплоидной, или полуперевиваемой. Непосредственно к такой культуре относятся диплоидные клетки человека.

Иногда, в процессе пассирования диплоидная клетка может трансформироваться и дать начало линии клеток, обладающих гетероп-лоидным набором хромосом и способных к неограниченному размно­жению в культуре, - так появляются перевиваемые культуры. К пере­виваемым культурам относятся злокачественные линии клеток человека и животных.

Развивающийся куриный эмбрион - наиболее простой и широко используемый объект для культивирования вирусов животных. Эмбри­он используют на 10-12 день развития. В это время аллангоисная по­лость куриного эмбриона содержит 5-10 мл жидкости. Наиболее про­стым способом внесения вируссодержащего материала является зара­жение в названную полость, оно будет более подробно рассмотрено ни­же. Для разных вирусов иногда приемлемы другие пути заражения ку­риного эмбриона: в полость амниона, в хорионаллантоисную полость, желточный мешок.

Перед заражением скорлупу яйца над воздушной камерой обра­батывают спиртом, обжигают на пламени, смазывают 2 % раствором йода, вторично протирают спиртом и обжигают. Границы воздушной камеры заранее обводят маркером при просвечивании. Над воздушной камерой в скорлупе проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц, скальпеля или же специального буравчика.

Шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала в ал-лантоисную полость (на 2-Змм ниже точных границ воздушной каме­ры). Отверстие в скорлупе заливают парафином. Вскрытие эмбриона проводят через 48-72часа при инкубации 37 С. Сначала скорлупу со стороны отверстия протирают спиртом и 2 % раствором йода, скорлупу рассекают ножницами, осторожно ее снимают, чтобы парафин и сама скорлупа не попали внутрь. Снимают подскорлупную оболочку и рас­сматривают хорионаллантоисную оболочку вокруг места заражения, отмечая наличие или отсутствие очагов поражения. С помощью пасте­ровской пипетки прокалывают хорионаллантоисную оболочку в участке, свободном от сосудов, и отбирают аллантоисную жидкость. Извле­ченную жидкость используют для проведения реакции ГА.

Хорионаллантоисную оболочку дважды промывают раствором хлорида натрия, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.

К недостаткам этого способа культивирования вирусов относят­ся: невозможность обнаружения исследуемого вируса без вскрытия эм­бриона, а также наличия в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку вирусов при изго­товлении различных препаратов.

Лабораторных животных для культивирования вирусов ис­пользуют в тех случаях, когда вирус плохо репродуцируется в культуре клеток или в эмбрионе. Но заражение организма лабораторного живот­ного - крысы, хомячка, морской свинки, кролика, мыши - посторонни­ми вирусами ведет к уничтожению животного. И для получения чистой линии данного вируса все же необходимо использовать культуры кле­ток.