23. Бактериологическое исследование различных объектов.

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме неё, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посева на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки.

Выращивание м/о-мов на питательных средах называется культивироаванием(лат. cultivire — выращивание); развившиеся м/о - культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензии, осадок или пленку; при развитии а плотной среде - колонии. Культуры могут быть чистыми (содержат потомство клеток одноговида м/о). Внесение клеток микроорганизмов или какого-либо исследуемого материала (образца почвы, пробы воды) в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры называется посевом. Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называется пересевом,или пассированием. Обычно микроорганизмы выращивают при определенной температуре в термостатах или термостатных комнатах. Культивирование при заданной температуре называется инкубацией, или инкубирование (лат. incubabion -выращивание при искусственно созданной температуре).Приготовление почненной суспензии для посева и техника посева Перед проведением микробиологического анализа влажную или сухую хорошо перемешанную почву высыпают на стерильное стекло; стекло стерилизуют спиртом и обжигают над пламенем горелки. Почву тщательно перемешивают шпателем, раскладывают ровным слоем, удаляют корешки и другие посторонние включения и тщательно отбирают средний образец, для чего почву берут шпателем из разных мест. Берут две навески почвы по 10г (для микробиологического анализа и для определения влажности). Навеску почвы, предназначенную для микробиологического анализа, переносят в ступку (стерильную), увлажняют её предварительно простерилизованным физиологическим раствором а растирают пестиком 5 мин. Затем количественно переносят навеску в чистую стерильную колбу вместе с физиологическим раствором. Все операции выполняют в боксе, вблизи от пламени спиртовки. Затем пробку обжигают в пламени спиртовки и закрывают колбу. Колбу с суспензией круговыми движениями взбалтывают в течение 10 мин, рукой или на качалке, которая дает более стандартное встряхивание. Необходимо следить, чтобы при взбалтывании не намокла ватная пробка.

После этого дают суспензии отстояться в течение 30 секунд, чтобы осели крупные минеральные частицы, которые в дальнейшем будут затруднять поступлении есуспензии в пипетки, и приготовляют разведение почвенной суспензии для осуществления посева питательный агар. Разведения делают по такой схеме: посев проводится из разведений 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 и т.д. в зависимости от группы учитываемых м/о-в, от типа почвы, сезона, влажности почвы. Наиболее точный подсчет получается, если на чашке развивается 50—200колоний бактерий и актиномицетов и 30—50 колоний грибов. При слишком густом или слишком разреженном посеве подсчет количества микроорганизмов будет не точным.При анализах почвы следует брать не менее 3—5 повторных образцов, и каждый из них высевается на 3—5повторных чашках для каждой из сред.

Из III-го, IV-го, V-го разведения последовательно набираем стерильными пипетками суспензии. Пипетку держим в правой руке, а левой рукой осторожно приоткрываем крышку чашки Петри с застывшей средой и вносим одну каплю суспензии. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его внутреннюю сторону крышки и растирают посевной материал по всей поверхности среды. Такой способ посева называются посев газоном. После инкубации посева появляется равномерный сплошной ростм/о. «Засеянные» чашки Петри ставим в термостат при температуре 28 0С.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку мизинцем и частью ладони, вынимают её, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки прокаленную петлю набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой, обжигая в пламени спиртовки. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская её до конденсата в нижней части среды и зигзагообразным или прямым движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают её пробкой. Петлю стерилизуют в пламени спиртовки в ставят в штатив. Такой метод посева называется посевом штрихом. Посев в столбик питательной среды делают бактериальной иглой, вводя

центральную толщину, — посев уколом. Посев микрофлоры воздуха проводят след.образом: чашку Петри с застывшей средой открывают и оставляют так на протяжении 30 мин. После этого маркируют и помещают в термостат при температуре 28-300С.Изучениемикрофлоры воды: пипеткой на 1 мл отбирают пробу воды, и 1 каплю вносят на застывший агар в чашке Петри, затем распределяют шпателем по всей поверхности.

Для изучения нефиксированных бактерий пользуются двумя методами: раздавленной (между предметным и покровным стеклами) капли и висячей капли. Следует помнить, что препараты нефиксированных бактерий заразны.

Для бактериоскопии фиксированных препаратов используют мазки. Для их приготовления каплю исследуемой жидкости распределяют по поверхности предметного стекла, а затем высушивают. Наиболее распространенным методом фиксации препарата является пронесение его через пламя газовой горелки. При посеве в жидкую среду надо следить, чтобы жидкость не выливалась и не смачивала края пробирок и пробки. Посевы и пересевы следует проводить вблизи пламени газовой горелки, пробирки не должны долго оставаться открытыми, петля или пастеровская пипетка с культурой не должна ни к чему прикасаться; перед тем как закрывать пробирку, края ее следует прожечь. Засеянные пробирки необходимо тотчас же надписать.

Важнейшим этапом бактериологического исследования является идентификация — определение видовой или типовой принадлежности бактерий, полученных в виде чистой культуры. При идентификации бактерий производится изучение их физиологических и биохимических свойств, токсинообразования.