Дифференциальная диагностика

ИБ необходимо дифференцировать от ИБК, НБ, БМ, лимфоидного лейкоза, саркомы Рауса, кокцидиоза, нефрозонефрита, аденовирусной апластической анемии, синдрома ожи­рения печени и почек, авитаминоза А, отравлений химическими иммунодепрессантами. При дифференциальной диагностике учитывают комплекс эпизоотологических, клинических, патологоанатомических, гистологических исследований и окончательно подтверждают виру­сологическими и серологическими результатами. Доказано бессимптомное течение ИБ цып­лят, которое удалось устанавливать с помощью гистологического и серологического иссле­дований в первую неделю после вылупления.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Применение живых вакцин

Выявление AT без выделения инфекционного агента не может служить основанием для вынужденной вакцинации. Прежде всего необходимо идентифицировать серопринадлежность вируса, определить вирулентность и подтип. Серотип II, индуцирующий ПА, а также AT, выявляемые с помощью ТФ ИФА, не вызывает патологии. Кроме того, следует уточ­нить, какой уровень AT и процент их циркуляции в стаде являются показанием для вынуж- I денной вакцинации. По данным зарубежных исследователей, надежный уровень защиты J. обеспечивают титр ВНА не ниже 2,0 lg, ПА 1:8 и выше, AT, выявляемых ТФ ИФА,- не ни- t же 1:8000. В связи с этим следует определиться с диагностическим титром в зависимости от | серологической реакции, применяемой для детекции AT, и уровня сероконверсии при исследовании парных сывороток. При проведении мер специфической профилактики необходимо учитывать факторы, отрицательно влияющие на формирование стойкого иммунитета у птицы, включая АГ-различия вируса ИБ. Это прежде всего тип АГ, способ и частота (схема) его применения в процессе вакцинации, степень аттенуации или инактивации. Известно, что живой АГ инду­цирует как системный, так и локальный (в местах наиболее вероятного проникновения возбудителя), а инактивированный АГ- только системный (гуморальный) иммунитет. Отрица­тельно сказывается на иммунной системе высокая плотность посадки птицы, несбалансиро­ванное кормление, нарушение технологических приемов, санитарного режима и, особенно, инфицированность стада различными возбудителями, токсины и т.д. Полноценное питание обеспечивает высокую естественную резистентность, а витамины A, D₃, E и Zn действуют как адъюванты, способствующие выработке полноценного и напряженного иммунитета.

Схемы иммунизации против ИБ не могут быть одинаковыми для разных хозяйств, не­обходим глубокий и всесторонний анализ с выявлением соответствия (АГ-родства) приме­няемых вакцин с циркулирующим среди птиц эпизоотическим штаммам ИБ. По наблюдениям ряда исследователей, общие ветеринарно-санитарные мероприятия не обеспечивают полного оздоровления хозяйств от ИБ. Поэтому в комплексе мероприятий по профилактике и ликвидации инфекции основное внимание уделяется специфической профи­лактике - вакцинации, которая должна проводиться с учетом материнских AT. Так, установлена высокая степень корреляции (г) между содержанием AT в сыворотке крови несушек и желтках: для вируса ИБ - 0,84, вируса ИБК - 0,84, для реовируса - 0,91. Опреде- t ление AT в желтке яиц при мониторинге бройлерных промышленных стад с помощью ELISA вполне выполнимо и рекомендовано для широкого использования. Цыплята, имеющие материнские AT в 1-сут возрасте, обычно защищены от появления клинических признаков болезни на протяжении первых 30 да жизни. Дифференциация полевых изолятов, отнесенных к серотипу I, показала, что АГ-родство между ними со­ставило всего 35%. Эти изоляты вызывали частичную атрофию бурсы без клинического проявления болезни и гибели птиц, но снижали их мясную продуктивность. У вируса серотипа II АГ-родство с другими штаммами было еще меньше. Поэтому один из основных факторов эффективности специ­фической профилактики - соответствие циркулирующих эпизоотических штаммов и реко­мендуемых вакцин против ИБ.

Разработанные в 70-е гг. первые вакцины из аттенуированных полевых изолягов часто не давали положительного результата и могли вызывать клиническую форму ИБ. Усовер­шенствованные в последствии, так называемые "умеренные" вакцины не могли преодоле­вать пассивный иммунитет, а у интактных цыплят вызывали иммуносупрессию и клиниче­скую форму болезни. Полученные затем аттенуированные вакцины из клонированного шт. PGB-98 (Baxenedal) и шт. D-78 успешно использовались для профилактики ИБ, но и они не преодолевали высокий уровень трансовариальных AT и, следовательно, не создавали на­дежной защиты. Поэтому усилия ученых были направлены на создание живых вакцин, спо­собных преодолевать пассивный иммунитет и формировать напряженный активный имму­нитет Такие "горячие" вакцины (Bursin+, Bursin 2, 228Е и др) обладали повышенной реактогенностью для цыплят с низким уровнем трансовариальных AT, вызывали переболевание, активизировали условнопатогенную микрофлору, что вело к осложнениям и повышенной летальности. Во ВНИИЗЖ были созданы живые вакцины на базе отечественных шт. БГ и Winterfild, которые применяются в настоящее время для профилактики заболевания. Од­нако в ряде случаев при применении этих вакцин наблюдались осложнения у птиц.

Стратегия борьбы с ИБ должна базироваться на эффективных ветеринарно-санитарных мероприятиях, а затем на эффективной специфической профилактике. В мировой практике широко используются вирус-вакцины из клонированных и в различной степени ат­тенуированных штаммов, обладающих разной реактогенностью. Их применяют в зависимо­сти от эпизоотологического и иммунологического статусов птицепоголовья. Профилактику ИБ осуществляют массовой вакцинацией. Племенные стада вакцинируют инактивированной или лиофилизированной живой вакциной из умеренно иммуногенного штамма. В Анг­лии, например, цыплятам 2-3-нед возраста вводят "умеренную" вакцину, а по достижении возраста 16-20 нед - инактивированную эмульгированную машинную вакцину. В Испании цыплят в возрасте 3 нед и повторно в 40 дн возрасте прививают вакциной из шт. D-78, а в 100 дн - инактивированной вакциной. Голландские специалисты рекомендуют различные вирусвакцины и схемы с учетом уровня материнских AT: для бройлеров от вакцинирован­ных родителей- вакцину из шт. 228Е в возрасте 14-17 дн, а от непривитых кур - 8-12 дн; для цыплят яичных пород от вакцинированных родителей - первично в возрасте 3 нед и повтор­но - 4 нед; от непривитых кур первично в 2 нед и повторно - в 3 нед возрасте; кур родитель­ского стада прививают инактивированной вакциной в 16-20 нед возрасте. Рекомендуют применять вакцины из шт. БГ и Winterfild в зави­симости от иммунного статуса птицы. Первично прививают в 5- или 10-дн возрасте, по­вторно - в 15- или 20-дн возрасте и третий раз в 100-120-дн возрасте жидкой инактивиро­ванной вакциной. Большинство исследователей считают, что необходимо выяснить, какой титр пассивных AT не будет сказываться отрицательно на формировании поствакцинального иммунитета в зависимости от реактогенности применяемых вакцин и выработать единый критерий оценки. Отечественная сухая вакцина против ИБ из шт. БГ в условиях неблагополучного хозяйства превосходит по эффективности вакцину Гумбораль (Франция) и Гумбораль СПФ (Хорватия). Она создает напряженный иммунитет при 2- или 1-кратной вакцинации цыплят в возрасте 10 сут и старше. В практике широко применяется сухая культуральная вакцина против ИБ из шт. ВНИВИП. Препарат безвреден для молодняка птиц и обладает выраженными иммуногенными свойствами. Установлено, что уровень материнских AT, соответствующий среднему по данной группе цыплят титру в ИФА 1:400, гарантирует достаточную защищенность птицы от инфекции и не препятствует эффективной вакцинации. По данным других исследователей, ма­теринские AT недостаточны для защиты цыплят от инфекции патогенным штаммом даже если куры-несушки были раньше вакцинированы бустерными дозами инактивированной масляной вакцины. Материнские AT могут интерферировать с вакцинным шт. D-78, кото­рый способен индуцировать образование AT в высоком титре.

Применение инактивированных вакцин. Для приготовления инактивированных вак­цин вирус ИБ размножают в КЭ и культурах клеток. Концентрацию АГ вируса определяют методом двойного сэндвич-ELISА. Вирус инактивируют формалином или рпропиолактоном, добавляют ГОА. Препарат вводят подкожно или внутримышечно. При достаточ­ной концентрации АГ (не менее 6 lg БОЕ), инактивированная вакцина обладала выражен­ной иммуногенностью.

Сообщается о полевых испытаниях сравнительной иммунологической активности 2-х серий экспериментальной эмульсинвакины БелНИИЭВ против ИБ и коммерческой вакцины такого же типа фирмы Интервет. Исследования показали, что вакцина БелНИИЭВ способна индуцировать у привитых ремонтных птиц сывороточные AT в защитных титрах и оказа­лась предпочтительнее вакцины Интервет.

Генно-инженерные (молекулярные) вакцины. Самым важным по иммуногенным свойствам оказался белок 35000 Д. Ген, кодирующий этот белок, встроенный в генетический аппарат E.Coli или дрожжевой клетки, индуцирует образование этого белка, который в очищенном и концентрированном виде представляет высокоэффективную абсолютно безвредную вакцину. Получена рекомбинантная субъеди­ничная вакцина, в которой основ ной протективный иммуноген — белок VP2, продуцируе­мый в высоко иммуногенной форме в дрожжах Scecharomyces cerevisiae. Рекомбинантный белок VP2 в виде мясляно-эмульсионной вакцины индуцировал ВНА и ELISA регистрируе­мые AT у кур, которые передавались потомству и предохраняли цыплят от заражения виру­лентным вирусом. Рекомбинантная субъединичная вакцина индуцировала АТ-ответ такого же уровня, который наблюдался у кур при введении им живого вируса. Поэтому считают, что рекомбинантный субъединичный препарат впоследствии должен вытеснить используемые в повседневной практике инактивированные вакцины. При вакцинации 1-сут цыплят наиболее выраженный иммунитет (не менее, чем у 90% привитых) наступает при введении живой вакцины, а спустя 24 дня - инактивированной. Прививка кур в 8-12-нед возрасте живой вакциной усиливает иммунный ответ на введение инактивированной вакцины в более поздний период. Создан высокоиммуногенный пептид VP2 вируса ИБ в виде агрегированной формы, состоящей из нескольких пептидов.

Кроме вакцинопрофилактики за рубежом в лабораторных условиях с положительными результатами были испытаны монАТ, полученные, в основном, на эпитопы протеина VP2 (VP2a и VP2b), ответственные за индукцию ВНА, а также на протеин VP3. AT на VP2a и VP2b предупреждали развитие инфекции у зараженных SPF-цыплят в 100% случаев, а на VP3 - всего лишь в 22%.

Серологическая оценка поствакцинального иммунитета. Динамика изменения титра поствакцинальных AT на живую и инактивированную вак­цину по данным ИФА и РН имела сходный характер. Преципитирующая активность в агаровом геле регистрировалась выше лишь в ИФА-позитивных сыворотках и пробах с определенным титром ВНА (90).

Лучшие результаты получены при выпаивании живой вакцины в 2-5-нед возрасте, а в 20-нед возрасте - от применения инактивированной вакцины. В ФРГ (Дессау) при сравнении аэрозольной и пероральной иммунизации получены сходные результаты. Пассивно иммун­ные цыплята были устойчивы к заражению вирусом ИБ в возрасте 7, 14, а иногда и свыше 20 да в зависимости от уровня и длительности сохранения материнских AT. Пассивные ПА выявляли до 13 нед возраста у цыплят, полученных от 1-кратно вакцинированных птиц. AT сохранялись на 4 нед дольше, если кур вакцинировали дважды. Однако это не увеличивало уровня иммунитета. У цыплят активный иммунитет развивался недостаточно, если уровень приобретенных материнских ВНА у них был около 7 1оg. Если тиры AT были ниже этого уровня, то вакцинация приводила обычно к репликации вируса в фабрициевой сумке при сильном ее поражении и последующем развитии активного иммунитета.

Установлено, что инкубационные яйца, полученные из хозяйств, неблагополучных по ИБ, невосприимчивы к этому агенту. Эта особенность была использована для определения степени благополучия птицеводческих хозяйств в ФРГ. Когда от вируса ИБ погибало свыше 75% зараженных эмбрионов, считали, что они полностью восприимчивы к вирусу, а хозяй­ства, из которых были получены яйца, относили к полностью благополучным. Партии инку­бационных яиц, где гибель эмбрионов составляла 25-75% и 0- 25%, относили соответствен­но к частично восприимчивым и полностью невосприимчивым, а хозяйства - к числу небла­гополучных по ИБ. Ввиду того, что вирус ИБ поражает иммунную систему птиц, ответст­венную за выработку гуморального иммунитета, косвенным показателем благополучия хо­зяйства могут служить результаты исследования продукции накопления AT в сыворотке крови птиц после вакцинации их против ИБ. В этом случае в неблагополучном по ИБ хозяй­стве вакцинация против ИБ не вызывает образования и накопления AT, при этом у 30-80% обследуемых птиц титры ГА были ниже 1:8, а индекс нейтрализации - ниже 2 lg.

В США для профилактики ИБ все поголовье в возрасте 14 дн прививают живой вакци­ной Burgine, которую дают с питьевой водой. Ревакцинацию проводят в 35-дн возрасте. Третья вакцинация - в 17 нед масляной адсорбатвакциной. По сравнению с живой она га­рантирует более продолжительную защиту родителей и более высокий титр материнских AT. Применяющаяся в Италии и Югославии на родительском стаде кур эмульсин-вакцина приводит к образованию высокого уровня ПА. Цыплята, полученные от таких кур, также имеют высокий уровень гуморальных AT. Введение на фоне базового иммунитета от живой вакцины инактивированной вакцины обеспечивает формирование у цыплят в первые недели жизни высокого уровня невосприимчивости, обеспечиваемого накоплением в яйце значи­тельного количества материнских AT (титр их 1:4000 в РН в культуре клеток). Последую­щее введение масляной вакцины доводит этот показатель до 1:100000. Активную иммуни­зацию целесообразно проводить только при содержании в крови AT в титрах не ниже 1:64.

В настоящее время контроль формирования поствакцинального иммунитета против ИБ целесообразно осуществлять с помощью РН и РДП. У всех цыплят, привитых живой вакци­ной, AT в сыворотке крови появлялись начиная с 3-4 нед и обнаруживались в РН и РДП. ПА после вакцинации в 4-5 нед возрасте они выявлены в среднем у 67,8% кур до 46-нед воз­раста. Материнские AT сохранялись у цыплят до 10 дн (в РДП) и до 20 дн (в РН). У 80-100% цыплят, полученных от вакцинированных кур, обнаруживали ПА, но к 17-дн возрасту они исчезали. Материнские AT передавались трансовариально и выявлялись в сыворотке крови цыплят в 1-,11-,19- и 25-дн возрастах у следующего количества птиц: в РН - у 86, 72, 30 и 22% (титр 1:16 и выше), в РДП - у 88, 69, 5 и 0% соответственно. У 1-сут цыплят положительная РН составляла 52,5%, что свидетельствовало о наличии материнских AT. В возрасте 30 дн число серопозитивных цыплят снижалось до 4,7%. Цыплята, полученные из яиц ферм, где болезнь регистрировалась, содержали материнские AT в течение 15 дн.

Как постинфекционные, так и поствакцинальные AT выявляются в РН. Так, при зара­жении молодых чувствительных цыплят вирусом ИБ получают хороший серологический от­вет. Определен иммунный ответ у цыплят различного возраста через 3 нед после их зараже­ния вирусом. Цыплята, иммунизированные в 4-нед возрасте, имели ИН 3,5, в то время как ИН у 3-дн вакцинированных цыплят находился в более низких пределах - 1,5-2. Взрос­лые птицы, так же как и молодые цыплята, слабо реагируют на вводимый АГ, возможно, из-за отсутствия функциональной активности бурсы Фабрициуса. Птица считается устойчивой к инфицированию вирулентным вирусом при титре AT в РН, равном 2 lg и выше, а в РДП -не ниже 1:8. 100%-ную устойчивость цыплят наблюдали через 3 дня после их вакцинации вирусом Си-1М. Титр AT у них в РН составлял 1:8, через 7 дн - 1:8000.

Что касается защитной роли пассивных материнских AT у цыплят, полученных от кур-реконвалесцентов или иммунизированных вакцинами, то в этом отношении имеется одно­значная трактовка: пассивные AT задерживают размножение вируса независимо от пути его инокуляции в КЭ. Передача родительских AT цыпленку подобным образом защищает его от заражения. Для оценки эффективности иммунитета, стимулированного вакцинами на сте­пень разрушения бурсы, предложено использовать морфометрический анализ. Для этого измеряют общую площадь и интегральную АГ плотность соседних фолликул на окрашен­ных гемотоксилинэозином гистологических срезах бурсы 3-х групп цыплят: невакциниро­ванных незараженных, невакцинированных зараженных вирулентным вирусом (II), вак­цинированных зараженных вирулентным вирусом (III). Заражение вирулентным вирусом проводили через 15 дн после вакцинации, а морфометрический анализ - через 10 дн после заражения. Общая площадь 10 фолликул у цыплят I, II и III групп составляла соответствен­но 6,25-10⁴, 5,54-10⁴ и 2,27-10⁴ мк, а интегральная АГ плотность - соответственно 392-10², 254-10² и 147-10² ед (68). Для определения титра AT и АГ ИБ предложен также метод ВИ-ЭФ. В качестве АГ используют гомогенат бурс от больных птиц в разведении 1:32 и сыво­ротки от переболевших и вакцинированных птиц. Метод ВИЭФ может быть с успехом ис­пользован для экспресс-диагностики ИБ и быстрой оценки иммунного статуса птиц.

Семейство: Herpesviridae.

Таксономическая структура семейства представленна в первой части лекций.

ИНФЕКЦИОННЫЙ ЛАРИНГОТРАХЕИТ ПТИЦ

Infectiose Laryngotracheitis des Huhnes (нем.), Infections laryngotracheitis(aнг.), Laryngotracheite infectieuse (франц.)

Инфекционный ларинготрахеит (ИЛТ) - вирусная контагиозаная респираторная болезнь поражающая кур, индеек, фазанов Впервые описан в 1925 г Мей и Титслер под названием инфекционный бронхит С 1931г ее стали именовать инфекционным ларинготрахеитом Ре­гистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство.

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ ,

Вирус впервые выделил Бичь в 1930 г в США

Морфология и химический состав. Геном вируса ИЛТ имеет длину 155 тыс пни состоит из длинной уникальной последовательности 1Д (120 тыс пн) и короткой уникальной последовательности Us (17 тыс п н ). Гликопротеины вируса ИЛТ были выделены из экстрактов вирусинфицированных клеток и очищены с помощью лектин-аффинной хроматографии Гликопротеины предохраняли 83 % птиц от заражения их патогенным вирусом. Гликопротеин В (gB) является первым структурным белком вируса ИЛТ птиц Клонирован, секвенирован ген этого белка.

Устойчивость. Вирус чувствителен к липолитическим агентам, теплу и различным де-зинфектантам Он длительно сохраняет свою активность в лиофилизированном состоянии или при - 20-60°С Температура 55°С разрушает вирус в течение 10-15 мин, а 38°С - за 48 ч В вируссодержащей трахеальной слизи больного цыпленка вирус разрушается в течение 44 ч при температуре 37°С, а в ХАО при 25°С в течение 5 ч В патологическом материале (трахее от больных кур) при температуре - 8-10°С он сохранялся более 370 дн В заморо­женных тушках больных и вынуждено убитых кур, хранившихся при температуре - 10, 18, 28°С , вирус оставался активным более 19 мес, на поверхности скорлупы в условиях термо­стата инактивируется через 12 ч, а в зараженных птичниках сохраняется не более 9 дн Пол­ностью инактивируется в 1 %-ном растворе креола в течение 30 с %

АГ вариабельность и родство. Все птичьи герпесвирусы на основании перекрестной РН сгруппированы в 11 разных групп. Штаммы вируса ИЛТ различаются по вирулент­ности для птиц и КЭ, тропизму, скорости выделения из клеток в тканевой культуре, устой­чивости при хранении, авидности, молекулярно-структурными особенностями Иммунологических различий среди штаммов вируса ларинготрахеита не обнаружено, хотя некоторые отклонения в способности нейтрализоваться гипериммунными сыворотками описаны у штаммов различной вирулентности.

Локализация вируса. Вирус обнаруживают главным образом в дыхательных путях, в меньшем количестве в печени и селезенке. При интратрахеальном заражении 30 дн цыплят его выделяли из трахеи и носовых ходов 7 дн, при ректальном заражении находили в фаб-рициевой сумке и трахее в течение 3 дн. У птиц-реконвалесцентов установлено длительное вирусоносительство. Из трахеи переболевших птиц вирус выделяли 2 дн. После острой фазы ИЛТ может наступить латентный период с сохранением генетического материала вируса в ДНК клеток ганглия тройничного нерва. При различных воздействиях может произойти ре­активация инфекции с выделением вируса во внешнюю среду.

АГ активность. ВНА у зараженных кур появляются со 2-3 нед после заражения, титр их достигает максимума к 5-му дн и сохраняется до 8-21 мес

Экспериментальная инфекция. Заразить восприимчивую птицу легко путем апплика­ции вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, трахеи, глаз, носа, под­глазничного синуса и клоаки. На 6-12 дн у зараженных цыплят развиваются типичные сим­птомы болезни. На 3-10 дн после внутритрахеальной инокуляции вируса у кур-несушек от­мечаются признаки умеренного респираторного заболевания. На 4-й дн в ткани трахеи и но­совой полости обнаруживается вирус. В период между 19 и 59 дн после заражения с помо­щью ЦПР периодически выявляется вирус. Ганглии тройничного нерва являются основным местом локализации вируса. У экспериментально зараженных СПФ-цыплят вакцин­ным шт. SA-2 вируса ИЛТ вирусный АГ в трахеальных смывах определялся до 7-го дн по­сле заражения, a AT против вируса в трахеальных смывах с 5-го дн после заражения. Иммуноглобулины класса А появлялись на 6-й день после заражения, а ВНА - только на 14 день. Вирус вызывал заболевания у индеек в возрасте 3-4 нед и 2-10 мес. Больные ин­дейки могут быть источником заражения кур. Данные о восприимчивости голубей к вирусу противоречивы Павлины и фазаны оказались чувствительными к вирусу, причем чувстви­тельность фазанов была выше Кролики, морские свинки и белые крысы резистентны.

Вирусовыделение. В экспериментальных условиях инфицированные птицы начинают экскретировать вирус через 8 дн после заражения Прединфекционный период может длить­ся 2 дн, а выделение вируса наблюдалось в течение 6 дн. Клинические признаки у заражен­ной птицы обычно появляются на 6 дн. В организме переболевших птиц вирус ИЛТ, как и многие другие герпесвирусы, может находиться в латентной форме. Полевые штаммы ,как и вакцинные обладают свойством персистировать в нервной системе Вакцинный вирус легко передается горизонтально. Поэтому при применении вакцины лучше иммунизировать всех цыплят птицефермы.

Культивирование. Вирус культивируется на ХАО эмбрионов кур, уток, индеек, неко­торых первичных и перевиваемых культурах клеток, не развивается в эмбрионах голубей и морских птиц. На ХАО образуются фокусные поражения 2 типов крупноузелковые с непро­зрачной белой периферией и некротическим центром и мелкоузелковые - без некроза. Узел­ковые поражения появляются на всей поверхности ХАО, а очаговые только на месте иноку­ляции вируса. В зараженных клетках ХАО образуются внутриядерные включения, а иногда гигантские клетки. В культурах линий СПЭВ, FJ, клеток фибробластов куриных эмбрионов, почки цыплят, утят, эмбрионов свиньи, новорожденных крольчат вирус вызыва­ет к 3-4 дн ЦПИ, характеризующиеся округлением и зернистостью клеток, лизисом их с по­следующим отторжением. В клетках СПЭВ формируются цитоплазматические включения и образуются многоядерные клетки. Внутриклеточные включения обнаруживаются через 12ч и к 30-36 ч после заражения достигают наивысшей концентрации. В инфицированных куль­турах клеток вирус вызывает образование бляшек.

ГА свойства. Вирус, репродуцированный в КЭ, не обладает ГА активностью Она про­является иногда в случае культивирования вируса в первичной культуре почки цыплят.

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больная и переболев­шая ИЛТ птица, которая длительное время (свыше 2 лет) остается вирусоносителем. Вирус от больных птиц можно выделить в течение 7 дн после появления симптомов болезни, после чего отдельные переболевшие птицы остаются вирусоносителями и периодически выделяют вирус, не обязательно при этом с переходом болезни в клиническую форму. Инфицирование может происходить и половым путем. Возможна передача вируса через зараженную скорлу­пу яйца. В условиях инкубатора вирус сохраняет инфекционность до 96 ч. После обработки яиц парами формальдегида он погибает через 40 мин. После острой фазы инфекции может наступить латентный период с сохранением генетического материала вируса в ДНК клеток ганглия тройничного нерва. При различных воздействиях может произойти реактивация инфекции с выделением вируса во внешнюю среду. Благоприятным фактором в плане иско­ренения инфекции в птицеводческих хозяйствах являются высокая степень видоспецифичности вируса, необходимость тесного контакта кур для распространения инфекции, быстрая инактивация вируса вне организма птиц, генетическая стабильность вируса, отсутствие раз­множения вируса в трахее при наличии местного специфического клеточно-опосредованного иммунитета.

Спектр патогенности в естественных условиях. В естественных условиях вирус по­ражает кур всех возрастов Фазаны и индейки также чувствительны к вирусу ИЛТ

Клинические признаки и патологоанатомические изменения. Инкубационный пе­риод колеблется от 2 до 30 дней Длительность его зависит от вирулентности, дозы вируса, метода введения в организм и физиологического состояния птицы Наиболее короткий ин­кубационный период , равный 40 ч , отмечен при интратрахеальном заражении Болезнь протекает сверхостро, остро и хронически Различают легкую и атипичную формы болезни, а по локализации поражений - ларинготрахеальную и конъюнктивальную формы Первая обычно протекает остро и сопровождается кашлем, удушьем, хрипом при дыхании. Катаральное или фибринозное воспаление слизистых оболочек можно наблюдать в носовой полости и инфраорбитальных синусах Слизистая оболочка в этих случаях гиперемирована набухшая, иногда пронизана мелкими точечными кровоизлияниями. В ротовой полости на слизистой оболочке можно находить легко отделяемые налеты беловатого цвета локали­зующиеся у корня языка, в углах клюва, окружности неба и у входа в гортань и глотку В ряде случаев отмечают катаральный фарингит На вскрытии изменения находят главным образом в гортани и трахее В просвете гортани обнаруживают казеозную пробку После ее удаления слизистая оболочка гортани неровная, красноватая, отечная, утолщенная Конъюнктивальная форма чаще наблюдается у цыплят и характеризуется катаральным или фиб­ринозным конъюнктивитом. Эта форма может протекать только с поражением конъюнкти­вы или в сочетании с ларинготрахеальной формой болезни У части птиц отмечают отек век, особенно нижнего У некоторых кур и цыплят развивается фибринозное воспаление конъюнктивы с отложением в конъюнктивальный мешок фибринозно-казеозных масс склеиванием век, помутнением роговицы, иногда с развитием панофтальмита. Изменения в легких при ИЛТ находят обычно у небольшого количества птиц. В некоторых случаях они ограничиваются только бронхами, в которых развивается катаральное, реже фибринозное воспаление, иногда в просвете бронхов обнаруживают сгустки крови или фибринозно-казеозные пробки.

Более характерные признаки ИЛТ отмечаются у цыплят-бройлеров в возрасте 4-7 нед и у кур-несушек в возрасте 18-76 нед. В ряде случаев одновременно с бронхитом выявляют катаральную пневмонию в виде небольших сероватых уплотненных участков, иногда с мел­кими очагами некроза желтоватого цвета Поражение воздухоносных мешков встречается сравнительно редко Однако при экспериментальном воспроизведении инфекции, особенно при интратрахеальном методе заражения, аэросаккулит часто находят у значительного ко­личества птиц Стенка воздухоносных мешков при очаговом или диффузном поражении утолщена, частично или полностью непрозрачные сосуды ее переполнены кровью. В полос­ти воздухоносных мешков находят серозный пенистый экссудат со сгустками фибрина или зернами фибринозно-казеозных масс В эпителиальных клетках трахеи уже через 12ч после заражения находят внутриядерные включения типа А. При обычном окрашивании они представляются однородными, а при серебрении выявляются аргининофильные гранулы.

При ларинготрахеальной форме болезни характерные изменения отмечают в гортани и трахее. Слизистая оболочка этих органов гиперемирована, отечна, эрозирована, с кровоизлияниями, а просвет их часто бывает заполнен катаральным или катарально-геморрагическим экссудатом. В большинстве случаев в гортани находят фибринозно-казеозные массы, закупоривающие просвет. При некоторых энзоотиях обнаруживают катаральное вос­паление слизистых оболочек носовой и ротовой полостей, а на корне и уздечке языка фиб­ринозные наложения. У некоторых кур наблюдают увеличение селезенки, катаральное вос­паление тонкого кишечника, фабрициевой сумки и клоаки. В бронхах и легких поражения встречаются редко, в виде катаральной бронхопневмонии. При конъюктивальной форме от­мечают серозный или фибринозный конъюнктивит с отложением в конъюнктивальный ме­шок казеозных масс, помутнение роговицы и поражение глазного яблока.

Гистологические изменения. Соответствуют картине вскрытия. В гортани и трахее находят серозно-катаральное или фибринозно-геморрагическое воспаление слизистой обо­лочки. В начале болезни выявляют гиперемию сосудов, дистрофию покровного эпителия и отек слизистой оболочки, в более поздние сроки некроз и десквамацию респираторного эпи­телия, инфильтрацию слизистой оболочки лимфоидно-гистиоцитарными элементами и пе-риваскуяярные кровоизлияния. В отдельных участках слизистая бывает некротизирована до хрящевого кольца. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки гор­тани, трахеи, конъюнктивы, легких, воздухоносных мешков, клоаки и народу с воспали тельной реакцией образует внутриядерные включения. Включения обнаруживают до насту­пления некроза эпителия между 1-5-м дн после заражения. Форма их округлая, овальная или продолговатая, количество в одре 1-4 , окружены светлым ободком. Описано спонтан­ное массовое некротическое поражение тимуса, фабрициевой сумки и селезенки у 40-дн цы­плят-бройлеров с признаками анемии. При вскрытии обнаружено уменьшение размера ти­муса и фабрициевой сумки, которые имели темно-желтый или коричневый цвет, отмечалась также диффузная аденоэктазия железистого желудка. При гистологическом исследовании наблюдали очаги фибрино-гнойного воспаления и некроза в тимусе, фабрициевой сумке и селезенке В гистиоцитах и лимфоцитах этих органов обнаружены одиночные крупные внутриядерные тельца-включения С помощью трансмиссионной электронной микроскопии в набухших ядрах с периферическим расположением хроматина гистиоцитов тимуса зафик­сировано наличие герпесвирусных частиц. При остром течении болезни вирус ИЛТ в 85-86% случаев обнаруживали в инфицированных клетках трахеи и гортани, в 80-88 % - в инфицированных клетках крупных бронхов и лишь в 60 - 62 % - в инфицированных клетках мелких бронхов и бронхиол. Вирус ИЛТ в 76-84 % случаев удается выделить из смывов но­соглотки, гортани и трахеи. При подостром и хроническом течениях положительные ре­зультаты получали при исследовании инфицированных клеток гортани и трахеи (96 %), бронхов и бронхиол (85 %), смывов носоглотки, гортани, трахеи (72-86 %), ЖКТ (до 60%) и печени (8-12%). Таким образом при хроническом течении болезни положительные резуль­таты по выделению вируса ИЛТ выше, чем при его остром течении, исключая печень. Тем самым диагностическая надежность метода вирусовыделения при исследовании органов птиц с разной степенью выраженности патологических изменений составляет от 85% (при остром течении) до 96% (при подостром и хроническом течении заболевания). Однако ме­тод вирусовыделения, обладая высокой специфичностью имеет существенный недостаток - значительную продолжительность во времени (до 45-52 дн).

Патогенез. Вирус проникает в организм через конъюнктиву, носовую или ротовую полости и репродуцируется в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани и трахеи, вызывая серозно-катаральное воспаление и образование внутриядерных включений. В по­раженных эпителиальных клетках происходит быстрое размножение ядер без деления цито­плазмы. Через 24 ч из мест поражения вирус поступает в кровеносную систему. На этой ста­дии заболевания обнаруживают дистрофию, некроз и десквамацию эпителия слизистой обо­лочки респираторного тракта, а в просвете трахеи слизистой экссудат с примесью крови. При дальнейшем течении болезни поражения слизистой гортани и трахеи усиливаются не только самим действием вируса, но и в результате происходящих в ней дистрофических из­менений. Отмечают сужение просвета дыхательных путей, а часто и образование казеозных пробок, что приводит к полной их закупорке и птица погибает от асфиксии.

ДИАГНОСТИКА

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков бо­лезни, и результатов лабораторных исследований. Часто болезнь протекает атипично, ха­рактерные признаки ее слабо выражены или их нет. В таких случаях решающее значение в диагностике приобретают лабораторные методы исследования

Выделение вируса. Взятие и подготовка материала. Для вирусологического исследования от больных птиц берут экссудат из трахеи, от павших или вынужденно убитых в начальной фазе болез­ни между 2-7 дн - слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы, носовых ходов и ку­сочки легких. Материал замораживают и сохраняют при - 20°С и ниже. Для гистологиче­ских исследований материал помещают в 10%-ный раствор нейтрального формалина. Из патологического материала готовят суспензию 1 5 на растворе Хенкса или изотоническом растворе NaС1, центрифугируют при 1500-2000 мин¹ в течение 15 мин, к надосадочной жидкости добавляют по 1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина в расчете на 1 мл выдерживают в течение 3-8 ч при 2-4°С. Затем используют для инокуляции КЭ, культуры клеток или не иммунных к ИЛТ цыплят

Заражение КЭ. Для каждой пробы используют по 10 эмбрионов в 9-12 да возраста. За­ражают на ХАО Погибших в первые 24 ч после инокуляции эмбрионов не учитывают Ос­тавшихся живых эмбрионов на 6-8-й дн убивают. Макроскопические изменения ХАО появ­ляются через 2,5-3 сут и достигают максимума к 5-6 дн. Штаммы вируса ИЛТ вызывают мелкоузелковые и очаговые поражения ХАО. Узелковые поражения обнаруживаются по всей поверхности ХАО, очаговые - только на месте инокуляции вируса. Необходимо учиты­вать, что не все штаммы вызывают гибель куриных эмбрионов на 4-6- дн. Для выявления специфических поражений надо провести не менее 3 пассажей, используя ХАО, суспендированную в аллантоисной жидкости предыдущего пассажа.

Выделение вируса надо подтвердить обнаружением телец-включений Зейфрида, РН, РДП, биопробой, а также ИФ и ЭМ.

Заражение культур клеток. Наиболее пригодны в данном случае культуры клеток по­чек эмбриона и цыплят, в которых первые изменения наблюдаются иногда уже через 24 ч после заражения, а через 48-72 ч в клеточной культуре обнаруживаются многоядерные ги­гантские клетки, в которых можно обнаружить внутриядерные включения Специфичность этих изменений доказывают ИФ или РН Наблюдение за культурой клеток проводят до 6-7 дн Для первичного выделения вируса так же пригодны клетки Vero

Индикация и идентификация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. Вирус ИЛТ размножается в эпите­лиальных клетках слизистой оболочки гортани, трахеи, клоаки, вызывая острое воспаление этих оболочек с образованием внутриядерных включений. Включения обнаруживаются до наступления некроза эпителия между 1-м и 5-м дн после интратрахеального заражения цы­плят. В мазках из конъюнктивы включения находят через 48 ч после заражения. Ядро, со­держащее включение, обычно увеличено, отмечается гиперхроматия ядерной оболочки. Включения имеют округлую форму, иногда форму диплококков и занимают 1/2 -1/3 кле­точного ядра. Вокруг включения видна неокрашенная зона, что считается характерным. Бо­лезнь можно диагностировать на основании обнаружения внутри ядерных включений. Для этого на предметных стеклах готовят мазки из соскобов эпителия слизистой оболочки, фик­сируют в абсолютном метиловом спирте в течение 3-5 мин окрашивают раствором краски Гимза (1капля краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 2 ч при 37°С, затем мазки промывают, обрабатывают абсолютным метиловым спиртом, снова промывают, высуши­вают и просматривают. В положительных случаях цитоплазма эпителиальных клеток окра­шивается в бледно-голубой цвет, ядерные оболочки таких клеток более темные, внутриядер­ные включения четко видны, светло- красного цвета, по форме варьируют (шарообразные или колбасовидные), окружены ясно видимыми светлыми ободками. Количество их в ядре от 1 до 4. Указанный метод позволяет иногда в течение 3-4 ч диагностировать ИЛТ даже при атипичном проявлении. Вероятность обнаружения телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни - между 2-7 дн.

ИФ. Позволяет обнаружить вирусный АГ при помощи специфической флюоресцирую­щей сыворотки в мазках из слизистой оболочки трахеи, конъюнктивы от больных цыплят (в период острого течения болезни), из пораженной ХАО и инфицированных культур клеток. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще используют прямой метод. Положитель­ную ИФ в мазках от больной птицы наблюдают в период острого течения болезни, когда обнаруживаются внутриядерные включения и можно выделить вирус на КЭ.

Биопроба. Ставят ее на цыплятах 30-90- дн возраста путем аппликации вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, трахеи, глаз, носа, подглазничного синуса, клоаки. При наличии вируса в исследуемом материале у зараженных цыплят на 6-12 дн раз­виваются типичные клинические признаки экспериментальной инфекции. При инокуляции материала в подглазничный синус в положительных случаях развивается синусит с отеком, выделениями из носовых ходов и слезотечением. Положительная реакция на клоачную про­бу проявляется с 3-го по 8-й дн, но чаще на 4-5 дн в виде отечности слизистой оболочки - фабрициевой сумки и катарального, геморрагического или фибринозного воспаления.

Наблюдение за зараженными цыплятами ведут до 14 дн. Чаще всего заражение проводят на слизистую оболочку трахеи и клоаки, так как этот метод позволяет определить виру­лентность штамма, а также провести дифференциацию от вирусов, вызывающих сходное поражение ХАО у инфицированных КЭ. При интратрахеальном заражении 4-нед цыплят вирулентным штаммом CS-1 вируса ИЛТ. Наибольший титр вируса в тканях трахеи (10⁶ БОЕ/г) установлен на 2-4-е сут. Позднее количество вируса резко снижалось и на 7 дн его не обнаруживали, хотя антиген вируса в эпителии трахеи и в большом количестве выявляли еще на 7-8 сут с помощью ИФ.

Последнее время естественные инфекции все чаще протекают нетипично, абортивно, хронически или даже бессимптомно. Выделяемые штаммы также менее патогенны для КЭ, не всегда приводят к их гибели и даже не всегда вызывают патологические изменения на слизистых оболочках при непосредственном введении исследуемого материала.

РН. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще всего в диагностической практи­ке используют метод: - разведение вируса и постоянная доза сыворотки. Результаты РН вы­ражают в индексах нейтрализации. Принято индексы нейтрализации от 1 до 9 считать отри­цательными, от 10 до 49 - сомнительными, от 50 и выше - положительными. РН можно про­водить и в культуре клеток ПЭК и 3-8 дн цыплятах.

РДП. Для идентификации возбудителя в РДП используют набор куриных антисыворо­ток, полученных к различным вирусам птиц. РДП ставят по общепринятой методике. Для РДП при диагностике ИЛТ птиц 1,5%-ный агаровый гель готовят на верональном буферном растворе с рН 7,2 следующим образом: в 100 мл горячей дистиллированной воды растворя­ют 1,84 г веронала, после охлаждения доливают дистиллированной водой до 1000 мл и рас­творяют в полученном растворе 10,3 г мединала. Раствор хранят при 4°С. Реакция проста по технике выполнения и позволяет выявлять примерно 75% положительных случаев, установ­ленных при помощи заражения эмбрионов. РДП специфична, но недостаточно чувствитель­на, ее используют главным образом для ретроспективной диагностики среди взрослых кур.

Приготовление гипериммунных сывороток и антигенов. Гипериммунные вирус-нейтрализующие сыворотки получают на кроликах по следующей схеме. Вирус (суспензии ХАО 1:10 после центрифугирования при 2500 мин¹ в течение 30 мин) вводят кроликам внутривенно в течение 3 нед по 3 раза в неделю (через 1 дн): в первую нед - по 2 мл, во вто­рую - по 3, в третью - по 4 мл. Через 7 нед после первичной иммунизации кролику внутрибрюшинно инъецируют 10 мл вируса, а на следующий день - 15 мл внутривенно. Через 7 дн после последнего введения АГ кроликов обескровливают. Гипериммунные кроличьи сыво­ротки используют в РН для типирования вируса ИЛТ.

Получение гипериммунных преципитирующих сывороток на птице Центрифугированную суспензию вируссодержащей ХАО в разведении 110 вводят взрослым петухам в подкрыльцовую вену в объеме 1-2 мл по схеме 4 инъекции с промежутками в 1 день, 7 дн отдыха, 4 инъекции с промежутками в 1 день. На 6-й дн после последней инъекции пробно берут кровь из сердца, в случае не активности сыворотки проводят трехкратное введение вируса с суточными интервалами, на 6-ой день вторично берут пробу крови. Установлено что препараты очищенного вируса ИЛТ, полученные в градиенте плотности глицерин-тартрата, более пригодны для выделения вирионной ДНК, тогда как препараты, очищенные в перколе, лучше использовать в качестве специфического АГ для ИФА и получения специ­фических сывороток. По данным ЭМ препараты вируса ИЛТ, очищенные в перколе, практически не содержат примесей клеточных компонентов (везикул).

Идентификация вируса с помощью монАТ. По чувствительности ИФА с монАТ со­поставим с методом выделения вируса, но более быстрым и более чувствительным по срав­нению с ИФ В ИФА используют кроличьи поликлональные AT и мышиные монАТ.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В нетипичных случаях, особенно при хроническом течении инфекции, провести диагностику позволяет установление роста титра антител при исследовании парных сывороток. Однако такого рода исследования про­водятся главным образом с целью получения данных, свидетельствующих о перенесении заболевания данной популяцией и указывающих на степень распространенности возбудите­ля на определенной территории. Пробы сыворотки от птицы исследуют дважды - через 14-28 дн интервал. Повышение титра антител к вирусу и числа положительно реагирующих птиц в стаде свидетельствует о наличии и распространении инфекции в хозяйстве, а сохра­нение или снижение уровня AT - о прошедшей инфекции. Для серологического исследова­ния кровь берут на 14-28-й дн от начала болезни не менее чем от 5-10 птиц по 5 мл от каж­дой. До начала исследования сыворотку сохраняют в замороженном состоянии при минус 20-70°С. Сыворотки больных и переболевших птиц, а также контрольные инактивируют при 56°С 30 мин.

Приготовление антигенов для РН и РДП. ХАО КЭ с характерными для данного ви­руса поражениями гомогенизируют с равным количеством буферного изотонического рас­твора с рН 7,2-7,4, к которому добавлены антибиотики из расчета по 100 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл раствора. Суспензию центрифугируют при 3000 мин¹ 20 мин. Надо садочную жидкость сливают и используют в качестве антигена, если она содержит вируса не менее 10⁵ ЭИДзо/мл АГ сохраняют в замороженном состоянии. Предложена следующая ме­тодика концентрации и очистки вируса вируссодержащий материал концентрируют полиэтиленгликолем с молм 6000, конечная концентрация его в вируссодержащей суспензии должна быть равна 7% Концентрирование ведут при 4°С в течение 3 ч, центрифугируют концентрированный вирус при 3000об/мин. 30 мин. Инфекционная активность полученного вируса - 1 О⁶-107 ЭИД ₅₀/мл

РН. Наиболее чувствительна по сравнению с РДП и РРИД. Она выявляет специфические AT у 96-98% инфицированных птиц независимо от формы течения заболевания. Одна ко эта реакция трудоемка и требует значительного количества КЭ. На КЭ или культурах клеток реакцию ставят по общепринятой методике, чаще используют модификацию посто­янная доза сыворотки и различные разведения вируса. Число рядов соответствует числу испытуемых сывороток плюс 2 ряда контроля (с нормальной и иммунной сыворотками), а число пробирок в ряду - числу разведении вируса. После контакта (1ч при комнатной тем­пературе) смесь сыворотки с каждым разведением вируса инокулируют не менее чем 4 КЭ на ХАО по 0,2 мл. Эмбрионы инкубируют при 37°С в течение 6 дн. При вскрытии выявляют специфические изменения на ХАО. В РН рекомендуется использовать неразведенные сыворотки. Оценку результатов проводят по индексу нейтрализации. Сыворотку с ИН 10 или меньше, считают отрицательной, а с индексом больше 10 – положительной.

РДП. Проводят по общепринятой методике, используя стандартный АГ Эта реакция может выявить 25-50% переболевших птиц. Однако простая техника постановки ее и бы­строе получение результатов дают возможность с минимальными затратами средств и вре­мени обследовать большое количество птицы. Специфический антиген готовят из вакцинно­го вируса ИЛТ клона НТ. Вируссодержашую суспензию - центрифугат гомогенизированных ХАО - концентрируют, используя 1%-ный раствор полиэтиленгликоля на дистиллированной воде, либо полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) при добавлении в суспензию из расчета 7%.

Антисыворотку к вирусу ИЛТ получают гипериммунизацией морских свинок и птиц. В первом случае используют концентрированный вирус ИЛТ с титром не ниже 10⁸ЭИД5о/мл^-, которым иммунизируют морских свинок по следующей схеме: первая иммунизация в объе­ме 0,1 мл внутрикожно в плантарную поверхность обеих лапок, вторая иммунизация - через 7-9 дн в объеме 1 мл подкожно в область верхней губы; последующие 2 инъекции - через 14-16 и 21-23 дн после второй проводят аналогично. Через 10 дн после последнего введения АГ морских свинок тотально обескровливают. Уровень AT в РДП составлял, как правило, 1 16 и выше, в лиофилизированном состоянии сыворотки сохраняли свою активность 2 г.

Птиц (молодок и петухов в возрасте 90-120 дн) гипериммунизируют по схеме: первый и второй раз (через 2 дн) иммунизируют специфическим АГ внутривенно в объеме 1 мл, тре­тий раз через 16 дн и четвертый раз через 30 дн -проводят интратрахеально в таком же объ­еме. Через 15 дн после последней иммунизации берут пробу крови и исследуют на актив­ность и специфичность. Если активность сыворотки в РДП со специфическим АГ 1:32 и выше, то у такой птицы тотально (из сердца) берут кровь, сыворотку от которой лиофилизируют и используют для выявления AT в органах и тканях больных и погибших птиц. Если титр специфических ПА в пробе сыворотки окажется ниже чем 1:32, то птицу им­мунизируют еще раз вирулентным вирусом ИЛТ в разведении 1:100 интратрахеально в объ­еме 0,5 мл. Через 10-12 дн птиц обескровливают и сыворотку лиофилизируют.

В качестве растворителя для приготовления геля используют 0,1М забуференный физ-раствор NaCl pH 7,2-7,4; забуференный фосфатный раствор состоит из 9 частей ОД5М рас­твора NaCl и 1 ной части 0,15М фосфатного буфера с рН 7,2 по Сервису, веронал-ацетатный буфер с рН 8,6 с ионной силой 0,1 и боратный буфер рН 8,4-8,6. Гель на этих буферных рас­творах готовят из расчета: 1,5 г агара на 100 мл растворителя. Растворяют агар в течение 1,5-2 ч в кипящей водяной бане, добавляя в расплавленный агар консервант (риванол, азид натрия и др.). Горячий агар разливают по 3 мл на предметные стенки или по 35 мл в чашки Петри, расположенные строго горизонтально. Как только агар затвердеет, пластинки можно использовать в РДП. Таким образом, для диагностики ИЛТ рекомендуется РДП на ага­ровом геле, приготовленном на боратном, либо фосфатном буферных растворах. РДП при­годно для выявления специфических AT в крови больных и переболевших птиц, а также ви­русного АГ ИЛТ в органах погибших птиц. Разработаны условия получения специфического вируса ИЛТ, активность его РДП 1:4-1:32, а в твердофазном ИФА 1:265-1:4000.

ELISA. Оказался более чувствительным, чем РН, по чувствительности приближается к ИФ У отдельных экспериментально зараженных цыплят с помощью ELISA и РИФ удава­лось выявить AT в более ранние сроки, чем в РН. Разработан твердофазный ИФА для выяв­ления специфических AT к вирусу ИЛТ в сыворотках крови вакцинированных птиц. Мето­дом шахматного титрования была выработана сенсибилизирующая доза антигенов и разве­дения иммунопероксидазного конъюгата. В ИФА можно выявлять специфические антитела в титрах 1:100-1:200 в сыворотках крови вакцинированных птиц. Аналогичные титры в РН и РДП соответственно составляли 1:8-1:32 и 1:2-1:16 (12). ELISA и РН (микрометод) ус­пешно применяли для обнаружения AT в стадах с субклиническим течением ИЛТ. Обнару­жить поствакцинальные AT к вирусу болезни в сыворотках цыплят с помощью ELISA уда­ется через неделю после вакцинации. Также предложен усовершенствованный метод ELISA путем введения в реакцию авидин-биотин-ферментного комплекса. Он пригоден и для оцен­ки поствакцинального иммунитета .

Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза на ИЛТ необходимо исключить НБ, оспу, ИБК, заразный насморк, хронический пастереллез, респираторный микоплазмоз и др.