Серологическая идентификация.

РТГА. Основной, высокоспецифичный и простой в выполнении метод идентификации вируса НБ. Для постановки необходимо иметь эталонные специфические сыворотки к виру­су и выделенный на КЭ вирус (аллантоисная жидкость) РТГА ставят общепринятым мето­дом в макро- и микровариантах. Идентификацию вируса считают завершенной, если эта­лонная специфическая сыворотка тормозит ГА-активность вируса в пределах целого или 1/2-1/8 титра с гомологичным эталонным АГ. Для быстрой идентификации выделенного вируса рекомендуют следующий метод: на предметное стекло наносят капли аллантоисной жидкости и 1%-ную суспензию куриных эритроцитов. Затем ставят пробу на нейтрализацию ГА-активности. Для этого на предмет­ное стекло наносят каплю той же аллантоисной жидкости, каплю эталонной специфической сыворотки и хорошенько перемешивают. Если агглютинации эритроцитов нет, значит вы­деленный вирус является вирусом НБ.

Приготовление гипериммунных сывороток. 5-8-мес кур с титрами анти-ГА поствакци­нального иммунитета против НБ 1:4-1:64 гипериммунизируют вирус-вакцинами из шт. В1, La Sola, Н. Первое введение делают с адъювантом (автоклавированная смесь ланолина с вазелином в соотношении 1:1,5). На 1 мл смеси добавляют 5 мл вакцинного вируса. Смесь растирают в ступке и помещают в водяную баню на 30 мин при температуре 56°С.

1-й раз вакцину вводят с адъювантом в объеме 1 мл внутримышечно, 2-й раз - через 3 дня без адъюванта, 3-й раз еще через 3 дня без адъюванта. Через 10 дн проверяют актив­ность гипериммунных сывороток Титр их обычно составляет 1:6144-1 12288.

РН на КЭ. Используют для идентификации вируса редко, так как она трудоемка и дли­тельна. Реакцию используют в спорных ситуациях РН ставят общепринятым методом обычно в варианте разведения вируса и постоянной дозы сыворотки. Реакцию считают по­ложительной при индексе нейтрализации >21g.

РСК. В диагностической практике при НБ используют редко. Предложена РСК как бы­стрый и дешевый метод дифференциации штаммов вируса НБ по вирулентности

РИФ. Метод основан на применении родаминсульфохлорида для конъюгации иммун­ной сыворотки к вирусу с целью идентификации вирусного АГ в пораженных клетках пав­ших и убитых птиц Применение этого красителя наиболее приемлемо и удобно благодаря яркому оранжево-красному свечению АГ. ФИТЦ-конъюгаты (флюоресцеинизотиоцианат) менее пригодны Для обнаружения специфического АГ применяют гомологичные РСХ-конъюгаты общепринятым методом. В большинстве случаев АГ выявляется в ядрах клеток белой крови (лимфоцитах, моноцитах, псевдоэозинофилах и эозинофилах) или пораженных клеток указанных органов в виде яркой флюоресценции оранжево-красного цвета. В кон­трольных препаратах, обработанных теми же гомологичными конъюгатами, подобного све­чения не наблюдается, лишь в некоторых случаях выявляется точечное желто-оранжевое свечение в цитоплазме юных эозинофилов. Установлено, что вирусный АГ в зараженных культурах клеток (ФЭК и ВНК-21) выяв­ляется, начиная с 4 ч (для велогенных штаммов) и с 6 ч (для лентогенных штаммов), до 10-12ч свечение АГ отмечали только в цитоплазме, а через 20 ч - в цитоплазме и ядрах клеток.

РИГА. Во ВНИВИП разработана методика получения высушенных стандартных высо­кочувствительных и специфических эритроцитарных тест-препаратов с AT к вирусу НБ для экспресс-диагностики. Указанный эритроцитарный диагностикум позволяет выявить вирус в экскретах органов и тканей .

ИФА. Методом ИФА вирусный АГ выявляют в ранние сроки после заражения до появ­ления ЦП Д. Через 12 ч после заражения видны единичные АГ-содержащие клетки.

Идентификация при помощи монАТ. Исследованы различные штаммы вируса и изс-ляты НБ на гомологичное родство к монАТ. В результате тестирования 40 изолятов и штаммов с использованием набора из 9 монАТ выявлено 8 групп. Вирусы каждой группы обладали не только общими АГ-свойствами, но и одинаковыми эпизоотическими чертами МонАТ к ГА и гликопротеину F рекомендовано использовать для определения патогенности и биологической характеристики штаммов, циркулирующих в стадах вакцинированных и невакцинированных птиц Они могут быть использованы для идентификации полевых изо­лятов, АГ-родственных шт. La Sota и В1, быстрой дифференциации этих вакцинных штам­мов от вирулентных полевых изолятов.

Метод картирования олигонуклеотидов. Этим методом исследован биохимический состав нескольких штаммов вируса НБ, выделенных в штатах Калифорния, Техас и Флори­да, это позволило легко дифференцировать штаммы друг от друга. Часть штаммов оказа­лись идентичными. Считают, что метод олигонуклеотидного картирования может быть эф­фективно использован с целью оценки эпизоотической ситуации.

Определение вирулентности выделенного вируса. Помимо серологической иденти­фикации часто возникает необходимость определения вирулентности выделенного изолята. Это важно, когда возникает подозрение, что выделенный возбудитель является штаммом, применяемым для массовой вакцинации. Степень вирулентности можно определить следующими методами.

Метод Хенсона - определение индекса внутримозговой вирулентности. Исследуемым материалом в разведении 1:10 заражают интрацеребрально в дозе по 0,05 мл 10 1-дн цып­лят, полученных от невакцинированных против НБ кур. Время наблюдения 8 дн. Все по­гибшие цыплята считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 2. Все цыплята, проявившие клинические признаки, тоже считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 1. Индекс интрацеребральной патогенности вычисляют путем деления суммы балов на 80 (число наблюдений за 10 цыплятами в течение 8 дн). Для ленто-генных штаммов индекс до 0,2, для велогенных штаммов - больше 1,5. Недостатком данной методики является - постоянный период наблюдения - 8 дн.

Метод определения среднего времени гибели 10-дн эмбрионов, вызванный минималь­ный летальной дозой (СВГ/МЛД). Для этого готовят серию 10-кратных разведении иссле­дуемого вируса от 10 ^-1 до 10^-10, пять из них (10 ^-1, 10 ^-7, 10 ⁸, 10 ⁹, 10 ^-10 используют для зара­жения 10-дн КЭ в аллантоисную полость в объёме по 0,1 мл. Каждым из этих разведении инокулируют по 10 КЭ: по 5 заражают в 8 ч утра и -в 16 ч (в общем заражают 50 эмбрио­нов) и инкубируют их при 37°С. Наблюдают за ними 2 раза в день через 8 ч в течение 120 ч. Час гибели каждого погибшего эмбриона регистрируют. Минимальной летальной дозой считают самое большое разведение вируса, вызывающее гибель всех инокулированных эм­брионов. Среднее время гибели находят путем деления суммы часов гибели всех эмбрионов, вызванной минимальной летальной дозой, на число эмбрионов: среднее время гибели до 60 ч - велогенные штаммы; среднее время гибели от 61 до 90 ч - мезогенные штаммы; среднее время гибели от 90 и больше 100 ч - лентогенные штаммы. Однако методы эти дорогостоящие и требуют много времени - необходимо затратить по меньшей мере 7 дн для того, чтобы дифференцировать дикие штаммы от вакцинных.

РСК. Быстрый и дешевый способ дифференциации штаммов. Диагноз ставят в течение 3 дн после получения проб. Самое слабое связывание комплемента вызывают велогенные дикие штаммы, самое сильное -лентогенные (например La Sota), в границах между сильны­ми и слабыми - мезогенные. Кроме того, вирулентные штаммы менее антигенны, чем вак­цинные, в отношении индукции синтеза КСА у морских свинок. Самую отчетливую диффе­ренциацию дает сыворотка морских свинок, иммунизированных штаммом Хитчнера.

Биопроба. Начиная с 1972 г. в США, а затем и в других странах были выделены штаммы с очень высокой вирулентностью. Их называют штаммами WND (висцеро-тропные штаммы НБ). Для идентификации проводится биопроба на восприимчивых цыпля­тах в возрасте не менее 6 нед. Цыплят заражают в клоаку. Несколько особей заражают в глаз, внося туда каплю вируса. За птицами наблюдают 10 дн. Если в течение этого периода ни один цыпленок не погибает, считают, что штамм не относится к WND. Если же птицы заболеют и погибнут в течение 10 дн, производят вскрытие В США принята следующая оценка интенсивности изменений (в баллах): точные кровоизлияния или некротические из­менения в трахее - 25; точечные кровоизлияния или некротические изменения в трахее и сопутствующая им отечность трахеи и в области входа в грудную клетку - 100; точечные кровоизлияния или некротические изменения в зобе - 100; некроз и изъязвление желез сле­пой кишки и пейеровых бляшек - 100; точечные кровоизлияния или некротические измене­ния слизистой оболочки клоаки - 10; воспаление брюшины в области яичника - 10; точечные кровоизлияния в других местах - 10. Диагностика VVND считается обоснованной, если об­щее число баллов достигает 150 или более.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

Критерием, позволяющим судить о персистенции вирулентного вируса в стаде, являют­ся титры AT в сыворотке крови птиц. Исследования проводят только с парными сыворотка-ми, полученными от одних и тех же птиц (или на одной и той же группе птиц). Первую про­бу берут перед вакцинацией (или в начале болезни), вторую - на 15-20-й день, последующие - в любое время (обычно 1 раз в месяц).

РТГА. Реакцию ставят с 4 ГАЕ в макро- и микровариантах по общепринятой методике Результаты считают положительными, если разница в титрах 1-й и 2-й сывороток составля­ет не менее 3-х разведении Повышение числа положительно реагирующих в РТГА между двумя исследованиями свидетельствует о распространении инфекции в стаде Постинфекци­онные AT обычно бывают в титре 10 lg и более и устанавливаются в течение продолжи­тельного времени, что указывает на проходящую или прошедшую инфекцию. Обнаружение в стаде птицы анти-ГА в разведении сыворотки крови 1:1024 - 1:2048 через 12-25 да после применения живых вирусвакцин не является сигналом о неблагополучии его в отношении НБ, наоборот, это свидетельствует о высокой реакции птицы на вакцину. Но если через 4-5 мес после вакцинации в стаде будут обнаружены титры AT 1:2048 или неровные титры, т е, когда у части проб крови (10-15%) их нет или они не превышают 1 2 - 1.4, а в другой части (14-20%) составляют 1:1024 - 1:2048 и выше, то стадо надо считать имевшим контакт с ви­рулентным вирусом.

Для определения активности эпизоотического процесса птиц через 2 нед обследуют по­вторно. Обнаружение высоких титров AT (1:4096 и выше) свидетельствует об обострении эпизоотической ситуации. Для серологического контроля из каждого птичника берут по 25 проб крови. Кратность исследований определяется эпизоотической ситуацией. AT обнаруживаются не только в сыворотке крови. Большое количество их содержится, например, в желтке яиц иммунизированных птиц. Этим путем происходит передача пассив­ной резистентности потомству. Обнаружение AT в желтке яиц, полученных от вакциниро­ванных кур, по мнению ряда авторов, более достоверно для определения состояния рези­стентности поголовья птиц. Готовят экстракт из желтка: в пробирку наливают 1,5 мл яичного желтка и 6 мл физиологического р-ра и тщательно перемешивают; добавляют 2 мл дихлорэтилена и 1 мл эфира. Содержимое тщательно смешивают встряхиванием. Оставля­ют смесь при 37°С до следующего дня, после чего центрифугируют в течение 10 мин при 1,000 мин ^-1 Фракция дихлорэтилена находится внизу на дне пробирки, над ней расположе­на полоса жира. Слегка мутную надосадочную жидкость (она соответствует разведению 1 5 желтка яиц) отсасывают пипеткой и используют в РТГА. Более простой метод заключается в следующем: желток отделяют от белка и 1 мл его разводят 2 мл фосфатного буфера с рН 7,2. Полученную смесь гомогенизируют, затем центрифугируют 15 мин при 1,000 мин ^-1. Для РТГА берут надосадочную жидкость между самым верхним слоем и осевшими частицами желтка. Титры AT в желтке соответствуют содержанию их в сыворотке крови кур. Считают, что для определения иммунного статуса стада кур к НБ значительно проще исследовать AT в яичных желтках, чем в сыворотке крови Такой подход экономичен, исключает стрессы и опасность распространения болезни при взятии крови. Исследуя желток, можно определить время первичной иммунизации цыплят, выведен­ных из анализируемой партии яиц. Титр пассивных AT в постнатальный период за 4,5 дня снижается на 1 log ₂.Так, при исходном титре AT 7 log к 18 дню он уменьшается до 3 log ₂, и до 5 log ₂ - к 9 дню. Надежный иммунный ответ будет получен у 80-100% птиц при вакцина­ции цыплят в указанном возрасте per os, интраназально или аэрозольно. Результаты иссле­дования желтка и парных сывороток кур позволяют судить об уровне сероконверсии и по нему определять напряженность поствакцинального иммунитета. Четырехкратное и более увеличение анти-ГА свидетельствует о циркуляции эпизоотического вируса. Аналогичное заключение делают по возрастанию индекса нейтрализации в 50-100 раз по сравнению с первоначальными данными.

Ставить диагноз по сероконверсии при внедрении полевого вируса в стадо иммунной птицы трудно без выделения вируса и определения его вирулентности на цыплятах Можно только предполагать, что птица имела контакт с полевым штаммом.

РРГ. Эта реакция (РРГ) получила широкое применение и высокую оценку при многих парамиксовирусных инфекциях. В опытах с вирусом НБ показаны линейная зависимость диаметра зоны гемолиза от концентрации AT и полная корреляция результатов РРГ и РТГА. Так, при титрах в РТГА 1:16-1:32 диаметр зоны гемолиза составлял 6-7 мм, а при 1:64 и 1.1024 - 7,5±0,3 и 9,5±0,5 мм соответственно. При повторных исследованиях одних и тех же сывороток расхождение показателей не превышало 0,5 мм.

ELISA. Многочисленные данные зарубежных исследователей свидетельствуют о высо­кой чувствительности, специфичности этого метода и корреляции между титрами AT в РТГА и ELISA. Разработан набор для скрининга сыворотки птиц на присутствие AT к НБ Титры в ELISA выше, чем в РТГА и показывают высокую степень корреляции. При исследовании сывороток крови от вакцинированных птиц титр AT в ELISA был в 2-4 выше, чем в РТГА. AT к вирусу в ELISA и РТГА выявляются в 98, и 91,7% соответст­венно, коэффициент корреляции равен 0_;85. Однако ELISA отличается большей чувст­вительностью. На основании реактивности с монАТ штаммы вируса НБ разбиты на 5 групп. Для постановки реакций ELISA и РЗГА при обнаружении AT к вирусу НБ целесооб­разно использовать хлороформный экстракт

Дифференциальная диагностика. НБ следует дифференцировать от ИБП, гриппа, ПМВ-2, ИЛТ и микоплазмоза птиц. Для лабораторной диагностики гриппа птиц, ИБ и НБ используют диагностикумы биофабричного производства. Дифференциация вирусов гриппа, насчитывающих 14 подтипов, и парамиксовирусов, включающих 9 серотипов, возможна только в лаборатории. Особое внимание следует сосредоточить на эпизоотологическом мо­ниторинге при этих болезнях, исследовании парных сывороток и периодическом лаборатор­ном анализе патматериала.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Естественно переболевшая или вакцинированная птица приобретает иммунитет, про­должительность и напряженность которого зависит от возраста птицы, биологических свойств вируса и метода введения его в организм.

Для специфической профилактики применяют инактивированные и живые вакцины. Количество первых последнее время значительно сокращалось. Однако односторонняя ори­ентация на живые вакцины разной степени аттенуации и в ряде случаев нежелательные по­следствия их применения вынудили исследователей и практических специалистов вновь вернуться к инактивированным препаратам, правда, более современным.

Применение живых вакцин. Ассортимент живых вакцин, применяемых в настоящее время весьма широк: Н, В, F, FR, Комаров, Roakin, Ла Сота, Банковский, Муктесвар, Мин-несот, Бургас, Нью-Джерси, Нью-Йорк, Накарелла, К, ГАМ, V4 и др. Среди вакцин­ных лентогенных штаммов вируса НБ известны - В, NDP, LZ58 и Clone 30, Ulster 2C.

В 1989 г. в Австралии выделен шт. N4, характеризующийся полной авирулентностью для птицы и активным распространением его среди птиц (высокой контагиозностью). Вирус вызывает иммунитет при введении интраокулярно, внутримышечно и аэрозольно. Он перси-стирует в организме привитой птицы до 2 лет. У подсаженной не привитой птицы к вакци­нированной в течение 80 дн обнаруживались AT. Несмотря на низкие титры (ниже 3 Iog2 ) привитая птица обладала устойчивостью к заражению вирулентным вирусом, что свидетельствует о развитии местного секреторного или клеточно-опосредованного иммунитета без высоких титров гуморальных AT .

Пероральная вакцинация шт.У4 (Австрия) стимулирует лимфоидные ткани кишечного тракта, что индуцирует секреторные иммуноглобулины и обеспечивает защиту даже при низком уровне циркуляторных гуморальных AT. Шт. V4, заданный с питьевой водой или кормом, после вакцинации выделяется в окружающую среду. По мнению авторов, перо-ральная вакцинация этим штаммом может разрешить ряд проблем профилактики НБ в не­больших фермерских хозяйствах. Пылевидная вакцина из шт La-Sota разработана во ВНИИВВиМ. В основе технологии изготовления использован метод сушки смеси вируссодержащего материала с наполните­лем. Вакцина обеспечивает высокий иммунологический эффект и практически не обладает реактогенностью в широком диапазоне доз, имеет выраженную иммуногенность для цыплят 14-16 нед возраста в благополучном и стационарно неблагополучном стаде птиц.

В ВГНКИ ветпрепаратов проведены исследования по совершенствованию методов кон­троля иммуногенности вакцин против НБ. Установленный минимальный защитный титр ан-ти-ГА 3 Iog2 и более давал вполне объективную информацию о иммуногенности вакцины Для исключения погрешностей в методику была включена референс-вакцина НБ, позво­ляющая правильно интерпретировать получаемые результаты и более дифференцировано подходить к оценке этого показателя у серийно производимого препарата. Референс-серии готовят во ВГНКИ, контролируют на соответствие заложенным в ТУ параметрам и постав­ляют на биопредприятия Новая методика предусматривает 10-кратный запас иммуногенно­сти и обязательное соответствие параметрам референс-серий не менее чем на 80% Экспе­риментально определены иммунизирующие дозы (НМД), обеспечивающие абсолютную за­щиту птицы от 1000 ЛД₅₀ вирулентного вируса (ИМД₉₀), равные для шт La Sota / 6,7 lg ЭИД₅₀, для шт. Бор/74 ВГНКИ - 6 lg ЭИД₅₀ при интраназальном применении и 7,7 и 7,0 lg ЭИД₅₀ соответственно при энтеральном применении. Они оказались значительно выше, чем в случаях применения серий вакцин с минимально допустимой по ТУ активностью (8,0 lg ЭИД₅о /см³). В связи с этим минимально допустимая инфекционная активность препара­тов увеличена до 9 lg ЭИД₅₀ /см³.

В СНГ широко применяют сухие вирусвакцины из шт. Н, Bl, La Sota, Бор/74/ВГНКИ. В профилактике НБ важна разработка оптимальной схемы иммунизации птицы Наиболее подходящий возраст для первой вакцинации - 10-14-й день, а для ревакцинации - 5-6 нед. Лучшие результаты получены при аэрозольной вакцинации в 10-дн, 5- и 8-нед возрасте. У индюшат осложнения после применения живой вакцины против НБ в 2-3 нед возрасте свя­зывают с подавлением вакцинным вирусом фагоцитарной активности альвеолярных макро­фагов. Во избежание этого предложена более рациональная схема иммунизации индюшат В первый день жизни им вводят подкожно инактивированную вакцину в дозе 0,1 мл, а через 2 нед аэрозольно вакцинируют живой вакциной из шт В1 Такая вакцинация обеспечивает длительный иммунитет. Высокий уровень поствакцинального иммунитета у матерей не пре­пятствовал иммунизации суточных индюшат инактивированной вакциной. В неблаго­получных товарных хозяйствах рекомендуют прививать индеек аэрозольно с интервалом 5 нед в течение всего производственного периода. Преимущество гранулированных форм вакцин из шт.У4 u Roakin в их более высокой термостабильности; их можно транспортировать без рефрижератора и смешивать с любым обычным кормом.

Активность клеточного иммунитета у цыплят, вакцинированных шт. V4 вируса НБ, оп­ределяли с помощью теста ингибиции миграции лейкоцитов (ИМЛ).

Исследовали роль защитных реакций слизистых оболочек в создании поствакцинально­го иммунитета. Цыплят вакцинировали 2-кратно с 2-неделышм интервалом интраназально, интраокулярно и введением вакцины в зоб. Каждый цыпленок получал дозу 7,8 lg ЭИД₅₀ /шт V4. Через неделю в сыворотке и слезной жидкости цыплят, вакцинированных всеми способами, обнаруживали повышение уровня AT. Оральная вакцинация inr.V4 индуцирует у цыплят не только гуморальные иммунные реакции, но и реакции иммунокомпетентных элементов слизистых оболочек. Показана высокая интерферирующая активность ПМВ-2, что необходимо учитывать при изготовлении эмбриональной вакцины против НБ .

Получена живая вакцина из мутанта шт. Hitchner В1 путем клонирования методом бля­шек серийными пассажами при температуре 28-30°С. Н.А. Лагуткин и соавт. реко­мендуют выпускать вакцины из шт. Bl, La Sota и Бор/74 ВГНКИ с активностью не ниже 9 lg ЭИД₅₀/мл и с титром в РГА не ниже 1:128. Доза при интраназальном (окулярном) введе­нии должна быть 2-4 млн. ЭИД₅₀/мл, а при пероральном применении 10-20 млн. ЭИД₅₀/мл с выпаиванием 2 дня подряд. Э.Ф. Токарик и соавт. рекомендовали свой способ профилактики НБ, суть которого со­стоит в том, что цыплят в суточном возрасте иммунизируют вакциной из шт. La-Sota в дозе 20-40 ЭИД₅о/на голову. После вакцинации цыплятам с кормом вводили пробиотик Авилакт-1К в суточной дозе 0,5 - 1,5% от массы корма 2-мя циклами по 7-15 дн с перерывом 15-12 дн. Использование пробиотика Авилакт-lK повышал антигенность вируса La Sota, усиливал иммунный ответ и устраняет нежелательное действие материнских AT при иммунизации су­точных цыплят. Экспериментальное обоснование эффективной дозы вакцины и перевод её дозировки с объёмных единиц в количественные (ЭИД₅₀) проведено во ВНИТИБП. Для цыплят 15-20-сут возраста эффективная защитная доза (защита 80-100%) при интраназальной вакцинации составляет 10³-10⁶ ЭИД₅₀ при титрах анти-ГА 1:8-1:512. Для цыплят 5-сут возраста, имевших материнские AT, эффективная доза составляет 10^б,3 ЭИД₅₀. В опытах с использованием для заражения цыплят как 100 ЛД₅₀, так и 2-10⁶ ЛД₅₀ вирулентного штамма вируса НБ показано, что применение вакцины в дозах 1-10⁶-5-10⁶ ЭИД₅о обеспечивало защиту как 5, так и 20-сут цыплят. Динамика накопления анти-ГА и устойчивости птицы следующая: на 4-й день титр анти-ГА составлял 1:8-1:16, степень за­щиты - 70%; на 6-й день - титр - 1:32, защита - 90%; на 8-й день титр - 1:32-1:64, защита 100%; на 14-й день титр - 1:64-1:512, защита - 100%. Максимальное накопление анти-ГА наблюдалось через 30 дн, к 120-му дню титр их снижался до 1:8-1:4. Однако степень защи­ты через 3 мес составляла 92-100%, через 5 мес - 70-85%.

Пассивный иммунитет у цыплят имеет прямое отношение к вирусоносительству и виру-совыделению. Так, при заражении пассивно иммунных цыплят патогенным вирусом 68% из них не проявляли признаков болезни в течение 80 дн наблюдения, но выделяли вирус в те­чение 45 дн, а вирусоносительство наблюдалось 54 дня. Этот факт имеет большое эпизоотологическое значение при проведении мероприятий по санации хозяйств от НБ.

Во ВНИИВВиМ разработана новая технология ассоциированной вирус-вакцины против ИЛТ и НБ. Она позволяет получать вакцины для аэрогенного применения с активностью 7 lg ЭИД₅₀ /см³ по вирусу ИЛТ и 7,2-7,7 lg ЭИД₅₀ /см³ по НБ; для интраназального и орально­го применения - по ИЛТ не ниже 7,0 lg ЭИД₅₀ /см³, по НБ не ниже 9,0 lg ЭИД₅₀ /см³. После двукратной вакцинации в оптимальных дозах иммунитет формируется у 85-100% птиц и со­храняется около 6 мес.

На основе мезогенного шт. ГАМ-61[А(в)ВН], выделенного из эпизоотического и затем аттенуированного в культуре клеток почек теленка и КЭ, разработана новая вакцина. После испытания в лабораторных и камеральных условиях установлено, что штамм обладает вы­сокой иммуногенностью: обеспечивает защиту 97-100% птицы, привитой различными спо­собами; безвреден в 10- и 100-кратной дозе для цыплят моложе 60-дн возраста, кроме того, его можно использовать в хозяйствах с острой эпизоотической ситуацией Иммунитет на­ступает через 72-96 ч. Высокая эффективность вакцины подтверждена на 8-миллионном по­головье птиц в стационарно неблагополучных хозяйствах Ставропольского и Краснодарско­го краев. Авто­рами изучен механизм формирования ранней невосприимчивости экспериментально инфи­цированных цыплят, привитых вакциной из шт ГАМ-61. Результаты опытов показали, что в механизме формирования ранней невосприимчиво­сти к вирусу НБ ведущая роль принадлежит факторам клеточного иммунитета. Защитное влияние гуморальных AT проявляется значительно позже, и в течение первых 3-5 сут не в полной мере отражает истинный иммунологический статус организма .

Аэрозольная вакцинация эффективна и безопасна только в стадах, благополучных по респираторным заболеваниям вирусной или бактериальной природы. В противном случае она провоцирует проявление ИЛТ, микоплазмоза и других болезней

Применение инактивированных вакцин. Инактивированные вакцины обычно при­меняют в сочетании с живыми. Хороший защитный эффект получали, если однодневных цыплят прививали живой вакциной, а через 3 и 8 нед - инактивированной.

Предложено одновременное применение живых и убитых вирусов НБ для вакцинации суточных цыплят с низким уровнем материнских AT. В качестве живой вакцины использо­вали лентогенный шт. La Sota, а в качестве инактивированной - формолвакцину, содержа­щую неионизированный детергент твин-80 в виде водно-масляной эмульсии с низким со­держанием минерального масла. Живую вакцину вводили в глазнично-носовую область, а инактивированную- подкожно Титры специфических AT у цыплят, привитых живой вакци­ной медленно возрастали в период с 28-го по 73-й день, в то время как уровень AT у цыплят второй группы, привитых одновременно живой и инактивированной вакцинами, был по­стоянен. Разовая одновременная вакцинация в инкубационном зале обеспечивает стойкий иммунитет на весь период откорма бройлеров и позволяет исключить ревакцинацию. Инактивированные вакцины готовят из вируса, размноженного в КЭ. Активность одной дозы вакцины обычно не менее 8 lg ЭИД₅₀/см³ инактивированного вируса Концентрация его оказывает существенное влияние на титр сывороточных AT В качестве инактивантов вируса НБ используют формальдегид, р-пропиолактон, этиленимин Хорошими адъювантными свойствами обладал авридин. Вакцина с авридином не вызывала реакций на месте введения. Помимо того, инактивированную эмульгированную вакцину типа "вода в масле" готовили с помощью р-пропиолактона и в качестве эмульгатора использовали арлацел и твин-80. Кур прививали в возрасте 8 нед, когда полностью исчезали материнские AT. Вакцину вводят 2-3 раза с 4-нед интервалом. Подкожное введение оказалось более эффек­тивным, чем внутримышечное. Максимальные титры сывороточных анти-ГА составляли 1:1280-1:2560. AT сохранялись в течение 30 или 35 нед соответственно после 2- и 3-кратной вакцинации. Напряженный иммунитет сохранялся свыше года. При хранении вакцины с адъювантом при 4°С более 18 мес ее эффективность не снижалась. При однократной вакци­нации кур в возрасте 16 нед титр AT начинал снижаться через 12 нед.

Вакцина против НБ оказалась эффективной против парамиксовируса птиц типа 3, вызы­вающего снижение продуктивности у индеек. Хороший иммунитет создавала вакцина из го­мологичного вируса, вводимая двукратно. Вакцина из парамиксовируса-3 защищала птицу от вируса НБ, но не наоборот, т.е. имеет место одностороннее АГ родство.

Оценка поствакцинального иммунитета. Эффективность вакцинации зависит от им-муногенности вакцинного штамма, наличия пассивного иммунитета, возраста цыплят, дозы и метода введения вакцины, соблюдения сроков между прививками, техники вакцинации, очередности применения более или менее аттенуированных штаммов, физиологического со­стояния организма птицы и пр. Поэтому схемы и методы вакцинации должны разрабаты­ваться для конкретных хозяйств исходя из эпизоотической ситуации. При проведении про­филактической вакцинации необходимо добиваться создания 100%-ного напряженного им­мунитета у птицы всех возрастных групп. Этого можно достигнуть в том случае, если в хо­зяйстве хорошо организована система контроля поствакцинального иммунитета. Эффективность вакцинации против НБ можно оценивать двумя способами: биопробой и определением титра анти-ГА. Во втором способе исследуют сыворотки в РГГА. Для этого через 12-15 дн после вакцинации берут кровь от 25 цыплят из 5-6 точек каждого птичника. Напряженность иммунитета проверяют также за несколько дней перед следующей вакцина­цией. В угрожаемых и бывших неблагополучных хозяйствах напряженность иммунитета у взрослой птицы проверяют через каждые 60 дн. Вакцинацию считают эффективной, если в более 80% проб исследуемой сыворотки крови цыплят в возрасте до 30 дн AT выявляли в разведениях 1:8 и выше, у молодняка до!20дн-1:16и выше, у взрослых кур - 1:64 и выше, меньшие титры AT служат показателем необходимости ревакцинации птицы. Анти-ГА появляются на 7-10-й день после вакцинации; титр их достигает максимально­го уровня 1:256-1:2048 к 25-30-му дню. Через 60 дн после вакцинации титры AT снижаются (1:8-1:256), а через 5-6 мес остаются только их следы. Через 2 мес после вакцинации у 99,5-100% исследованных желтков яиц титры AT выше 1:8. Выявлена четкая корреляция титров в сыворотке крови и пульпе пера в отношении материнских AT, так и в отношении активно выработанных AT на 60-96-й дн после вакцинации. Если после ревакцинации уровень сероконверсии равен 1,2 и более, то иммунизация проведена качественно и своевременно, если он ниже 1,2 или отрицательный, то прививка птицы была сделана без учета титра пассивных или высокого титра активных AT. Случаи низкой сероконверсии или слабой напряженности иммунитета после первичной вакцинации отмечают при недостаточном АГ-раздражении (заниженной прививной дозе), иммунизации птицы с высоким титром AT, сближении срока ревакцинации и частых АГ раздражении (многократные вакцинации за короткий промежуток времени), нарушении гигиены кормле­ния и содержания, острых инфекционных болезнях или влиянии других иммунодепрессивных факторов. Высокий уровень AT и сохранение его в течение года и более после однократной имму­низации вирусвакцинами из штаммов Bl, La Sota, F, Br или инактивированной ГОА-вакциной свидетельствует о циркуляции среди птиц полевого вируса НБ.

Необходимо обратить внимание на недостаточное АГ раздражение при оральном при­менении вакцины. Однократное выпаивание препарата в рекомендуемых дозах индуцирует выработку специфических AT только у 20-70% птиц, а применение его 2 дня подряд, как правило, обеспечивает устойчивость к вирулентному вирусу у 80-100%.

Генно-инженерные вакцины. Сконструирован рекомбинант вируса оспы птиц, экс-прессирующий ГА-нейраминидазный протеин вируса НБ. Рекомбинант обладал выражен­ными защитными свойствами - птица, иммунизированная внутримышечно, после одной прививки через 28 сут выдерживала заражение вирулентным вирусом. Для получения рекомбинантной живой вакцины ген слияния А вируса НБ клонировали под контролем про­мотора Р75 в вакцинный штамм ВЧП по Coity Spel. Был отобран один рекомбинант fp EFF2, у которого ген F был выявлен в концевых повторах геномной ДНК. Считается что данная векторная система может быть использована для получения генно-инженерной мультива-лентной вакцины, экспрессирующей гены таких патогенных для птиц вирусов как ИБ, БМ, ИЛТ, ИББ.

СОДЕРЖАНИЕ

Семейства: Adenoviridae………………………4

Birnaviridae………………………17

Herpesviridae……………………..32

Рaramyxoviridae………………….43