11. Принцип действия, достоинства и недостатки геномных секвенаторов 3 поколения

Основные характеристики методик третьего поколения:

1. Сиквенс одиночных молекул ДНК

2. Не используется клонирование ни in vivo, ни in vitro

3. Максимальная миниатюризация

4. Значительное повышение скорости реакций

5. Увеличена длина читаемой последовательности

6. Существенное удешевление секвенирования

7. Разработка нескольких методов на стадии технологической демонстрации, пилотная установка в конце 2010 года пяти секвенаторов одной модели

Используемые принципы секвенирования:

1. Микроскопия одиночных молекул ДНК

2. Распознавание нуклеотидов при прохождении цепи ДНК через нанопору

3. Визуализация включения нуклеотидов в цепь ДНК-полимеразой за счёт резонансного переноса энергии между флуоресцентно мечеными нуклеотидами растущей цепи и включаемым нуклеотидом.

4. Визуализация включения нуклеотидов в цепь ДНК-полимеразой за счёт возбуждения флуоресценции присоединяемого нуклеотида в активном центре фермента.

Наиболее сложная проблема методик 3 поколения – это детекция очень слабого сигнала одиночного флуорофора среди флуоресценции многих меченых нуклеотидов.

Принцип действия:

Процесс проходит в ячейках (микропорах). Диаметр ячейки значительно меньше длины волны света, поэтому свет через неё не проходит, однако самое дно ячейки освещается. В каждой ячейке иммобилизуется одна молекула ДНК-полимеразы. В ходе синтеза ДНК полимеразной флуоресцентные нуклеотиды только на очень короткое время попадают в освещённую зону, однако присоединяемый нуклеотид задерживается в активном центре фермента надолго, что даёт сильный импульс флуоресценции. При случайной диффузии дНТФ находится в освещённой зоне несколько микросекунд. При связывании с ферментом во время реакции дНТФ находятся в освещённой зоне десятые доли секунды, что даёт чёткий пик флуоресценции.

Характеристики:

1. Длина считываемой последовательности не менее 1500 нуклеотидов

2. Число ячеек чипа 1000

3. Скорость секвенирования до 10 н.п. в секунду

12. Аннотация геномных последовательностей: основные задачи и подходы к их решению.

Основные задачи:

• Идентификация кодирующих последовательностей

• Идентификация регуляторных последовательностей

• Идентификация функций генов

Виды решения задач:

• Компьютерные методы

• Экспериментальные подходы

Для идентификации кодирующих последовательностей применяются сложные алгоритмы.

Наиболее надёжными при идентификации генов являются программы, использующие все доступные критерии кодирующих и регуляторных последовательностей.

Для интегральной оценки данных большинство таких программ используют скрытые марковские модели генов или искусственные подходы нейронные сети( а некоторые программы – комбинацию двух подходов). Наиболее надёжными при идентификации эукариотических генов являются программы использующие искусственные нейронные сети.

Программы для идентификации генов: GeneMark( бактерии, дрожжи, рис, человек), Grail( человек, мышь), GenSkan( человек, кукуруза), GeneBuilder( человек, мышь, крыса).