9.Принцип действия, достоинства и недостатки геномных секвенаторов 2 поколения использующих днк полимеразную реакцию (секвенирование путём синтеза illumina)

Основные принципы методик секвенирования второго поколения:

• Исключено клонирование in vivo

• Полный отказ от электрофореза

• Только флуоресцентные метки

• Миниатюризация и параллелизация реакций

• Секвенируемые фрагменты короче, но их гораздо больше

• Максимальная автоматизация

• Возможность однократно секвенировать геном человека за неделю

Illumina HiSeq 2000

Принцип: детекция флущресценции присоединяемых ДНК-полимеразой нуклеотидов.

Выход на рынок: 2008 год

Длина читаемой последовательности – 100 н.п.

Количество одновременных реакций: 2 млн

Продолжительность рабочего цикла: 8 дней

Количество оснований в сутки: 25 млрд н.п.

Стоимость секвенирования генома человека: <10000$

Реакции происходят в проточной камере с 8 каналами. Далее секвенирование роходит по технологии создание кластера матриц(фрагменты ДНК иммобилизуются на поверхности проточной камеры, затем амплифицируются при помощи ПЦР). Результат: до миллиарда кластеров с идентичными молекулами ДНК в каждом. Потом секвенирование проходит по технологии illumina регистрация включения нуклеотида. Пошаговая процедура, один шаг включает:

• Присоединение нуклеотида с флуоресцентным терминатором

• Считывание флуоресценции

• Отсоединение терминатора вместе с флуоресцентной меткой

Потом секвенирование проходит по технологии illumina считывание последовательности ДНК (после присоединения каждого нуклеотида прибор сохраняет изображение флуоресценции всех кластеров проточной камеры. Анализ изображений позволяет определить последовательность присоединённых при копировании каждой матрицы нуклеотидов.

Недостатки:

• Постоянные остановки и перезапуск полимеразной реакции приводят к ошибкам и существенно ограничивают длину последовательности ДНК, которую можно считать

• Небольшая длина считываемой последовательности

10. Принцип действия, достоинства и недостатки геномных секвенаторов 2 поколения использующих детекцию протонов (ion torrent)

Основные принципы методик секвенирования второго поколения:

• Исключено клонирование in vivo

• Полный отказ от электрофореза

• Только флуоресцентные метки

• Миниатюризация и параллелизация реакций

• Секвенируемые фрагменты короче, но их гораздо больше

• Максимальная автоматизация

• Возможность однократно секвенировать геном человека за неделю

Personal Genom Machine

Чипы:

Ion 314 (в продаже)

• 1.2 млн. ячеек

• 10 млн. п.о.

Ion 316

• 6.1 млн. ячеек

• 500 млн. п.о.

Ion 318

• 11 млн. ячеек

• 1000 млн. п.о.

Принцип: детекция флущресценции присоединяемых ДНК-полимеразой нуклеотидов.

Выход на рынок: 2011 год

Длина читаемой последовательности – 100 н.п.

Количество одновременных реакций: 2 млн

Продолжительность рабочего цикла: 2 часа

Количество оснований в сутки: 25 млрд н.п.

Стоимость прибора: 100000$

Стоимость одного прогона: 250$

Принцип «полупроводникового» секвенирования в Personal Genom Machine

Чип содержит массив микроячеек, в каждой из которых – уникальная матрица. Под ячейками – иончувствительный слой, а ещё ниже сенсор.

При присоединение нуклеотида к цепи ДНК освобождает один протон, и это регистрируется за счёт детекции изменения рН в каждой ячейке.