5.Сложности расшифровки генома эукариот и пути их преодоления

6. Синтез днк in vitro: компонетны и продукты реакции, свойства днк-полимераз. Способы использования реакции полимеризации днк для определения нуклеотидных последовательностей.

7. Секвенирование днк по методу Сэнгера: возможности и ограничения

Основные принципы методик секвенирования первого поколения:

• Создаётся набор коротких фрагментов ДНК, один из концов которых идентичен для всех фрагментов, а второй варьирует и соответствует всем возможным позициям одного из 4 нуклеотидов.

• Электрофорезом в полиакриламидном геле с точностью до 1 нуклеотида определяется длина полученных фрагментов.

• Считывание последовательности производиться путём сопоставления размеров фрагментов, соответствующим позициям каждого из 4 нуклеотидов.

Методика Сэнгера предполагала ферментативную реакцию. М. Сэнгера со временем была немного улучшена, на сегодняшний день позволяет детектировать чуть более 1000 н.п. (1300 - это абсолютный максимум, который она дает), и ограничения не на саму реакцию секвенирования, а на разрешающую способность полиакриламидных гелей. Этот метод был максимально автоматизирован (разработаны первые автоматические секвенирующие машины) и в принципе автоматизировано большинство стадий сиквенса в определении плазмидной ДНК, что естественно удешевили саму процедуру сиквенса и именно с помощью этой методики получена вся геномная информация, которая сейчас содержится в базе данных.

Достоинства: Недостатки:

• Предельная простота * высокая трудоемкость

• Дешевизна * ограниченное разрешение геля

• Наглядность

Компоненты реакции секвенирования:

• ДНК-матрица

• Олигонуклеотидный праймер

• ДНК-полимераза

• Буфер и смесь нуклеотидов, включая дидезокситерминатор

Матрицей для секвенирования всегда является одноцепочечная ДНК, которая в зависимости от секвенируемой молекулы и используемого метода секвенирования может быть получена по-разному.

Праймеры:

• Универсальный

• Внутренний

Требование к ДНК-полимеразам:

• Высокая процессивность. Отражает число нуклеотидов, включаемых полимеризой в синтезируемую цепь до её диссоциации. Полимераза не должна терменировать синтез ДНК до включения дидезоксинуклеотида.

• Минимальная (или нулевая) 5’-3’ экзонуклеазная активность. Эта активность будет укорачивать синтезированные цепи с 5’ конца, что делает чтение сиквенс неаозможным.

• Минимальная (или нулевая) 3’-5’ экзонуклеазная активность. Эта активность приводит к укорочению цепи с 3’ – конца, что к тому же уберёт терминирующий нуклеотид.

Основные причины высокой трудоёмкости и стоимости методики Сэнгера:

• Использование электрофареза для регистрации продуктов реакции

• Необходимость создания библиотеки клонов для секвенирования

• Необходимость выделения и очистки ДНК из большого числа клонов

8. Принцип действия, достоинства и недостатки геномных секвенаторов 2 поколения использующих реакцию пиросеквенирования

Основные принципы методик секвенирования второго поколения:

• Исключено клонирование in vivo

• Полный отказ от электрофореза

• Только флуоресцентные метки

• Миниатюризация и параллелизация реакций

• Секвенируемые фрагменты короче, но их гораздо больше

• Максимальная автоматизация

• Возможность однократно секвенировать геном человека за неделю

Genome sequencer FLX (Roche)

Принцип: детекция пирофосфата отщепляемого при включении каждого нуклеотида.

Выход на рынок: 2004 год

Длина читаемой последовательности – 400 н.п.

Количество одновременных реакций: 1,25 млн

Продолжительность рабочего цикла: 6 часов

Количество оснований в сутки: 1,25 млрд н.п.

Пиросеквенирование использует подход определения нуклеот. последовательностей в основе которого лежит синтез ДНК, т.е. так же работает полимераза, продукты реакции детектируются таким образом: образуется пирофосфат - 2 фосфатные группировки, которые связаны. При присоединении любого нуклеотида освобождается пирофосфатная группировка, и вся методика основана на детекции пирофосфата. Детектируется в ходе двухстадийной реакции: сначала фермент сульфурилаза из пирофосфата и аденозин-фосфо-сульфата собирает АТФ, затем этим АТФ активируется люцифераза и окисляет люциферин с выделением кванта света.

Технология пиросеквенирования:

1. Конструирование библиотеки ДНК

• Ультразвуковая фрагментация анализируемой ДНК

• Пришивка адаптеров и денатурация ДНК

2. Эмульсионная ПЦР

• Получение эмульсии, содержащей в микрокаплях еденичные фрагменты ДНК и полистирольные шарики с пришитым праймером

• Проведение эмульсионной ПЦР

• Отмывка микрошариков от реагентов и удаление несвязанных с шариками нитей ДНК

3. Загрузка пикотитровальной планшетки

• Загрузка шариков в лунки проточной камеры

• Загрузка лунок микрокапсулами с иммобилизованными ферментами

4. Секвенируюшая реакция

Перспективы пиросеквенирования:

1. Увеличение длины прочтения до уровня метода Сэнгера

2. Автоматизация эмульсионной ПЦР