31. Организация генома Drosophila melanogaster

Первым из членистоногих был отсеквинирован геном дрозофилы. Дрозофила – очень удобный экспериментальный объект. На момент начала геномного проекта 2,5 тысяч генов уже было охарактеризовано, клонировано, секвенировано и нанесено на генетическую карту. Генетические карты дрозофил существуют примерно сто лет (1913 г). Сиквенс генома дрозофилы был сделан под руководством Вентера.

Дрозофила оказалась удачным объектом для секвенирования и сточки зрения геномики, т. к. она имеет очень компактный геном (всего 180 млн нуклеотидных пар).

Геном дрозофилы является самым небольшим среди известных геномов членистоногих. Около трети генома дрозофилы существует в виде гетерохроматина. В связи с тем, что гетерохроматиновые участки вообще не клонируются в бактериальных векторах (токсичны для них), Вентер не сиквенировал гетерохроматин дрозофилы. Т. к. в гетерохроматине содержится только небольшое количество генов, решение Вентера является достаточно обоснованным. После секвенирования генома дрозофилы никто и не пытается сначала клонировать и изучать гетерохроматиновые участки. В первую очередь секвенируется эухроматиновая часть генома, а только потом, по возможности, пытаются с концов «вгрызца» в гетерохроматин. У дрозофилы есть всего 2 больших аутосомы, половые хромосомы (Х и У хромосомы) и одна маленькая аутосома. Маленькая аутосома содержит большое количество гетерохроматина. У хромосома почти полностью состоит из гетерохроматина. Небольшое количество хромосом у дрозофилы также значительно облегчило осуществление данного геномного проекта. В геноме дрозофилы имеется больше повторов, чем у Caenorhabditis elegans и фракция кодирующего генома значительно меньше, что представляло проблему для расшифровки генома. Поэтому Вентер использовал модификацию шотган-подхода.

Основная часть сиквенса осуществлялась с использованием pUC со вставками приблизительно 2000 нуклеотидных пар и библиотеки такого же типа, но с более крупными вставками (10000 нуклеотидных пар) и векторами меньшей копийности, чем pUC. Копийность векторов с большими вставками следует снижать, чтобы избежать гибели значительной части клеток, содержащих такие векторы. Для секвенирования генома Caenorhabditis elegans также использовалась библиотека на основе БАКов (бактериальные искусственные хромосомы). БАКи стабильно «держат» вставки приблизительно 100000 – 150000 (иногда даже до 300000) нуклеотидных пар. Обычно в геномных проектах такие вставки составляют от 100 до 150 тысяч нуклеотидных пар. В данном случае средний размер вставки в БАКах составлял 120 -130 тысяч нуклеотидных пар. Библиотека на основе БАКов использовалась для «стыковки» фрагментов генома между собой, в пределах концов каждого БАКа. Поскольку известно, что два таких сиквенса принадлежат к концу одного фрагмента размером 130000 нуклеотидных пар, можно было «состыковать» различные контиги между собой. Таким образом, становилось понятно, какие фрагменты ДНК нужно прицельно секвенировать на стадии финиширования. Кроме того с БАКами проводилось STS-картирование. Вентер использовал уже имеющиеся физические карты и сделал STS-карту генома дрозофилы, используя БАК библиотеку в качестве реагента для картирования. Тогда STS-маркеры было достаточно легко секвенировать, потому что значительная часть генома дрозофилы на тот момент уже была секвенирована. В данном геномном проекте активно использовалась очень старая карта политенных хромосом, карта политенных хромосом дрозофилы, которая была сделана в 30-е года 20 века (позже она была насыщена). К моменту осуществления геномного проекта была произведена привязка некоторых БАКов за счет FISH гибридизации (флуоресцентная гибридизация in situ). Карта политенных хромосом была сделана с достаточно высоким двадцатикилобазным разрешением (очень хорошее разрешение) с привязкой ключевых локусов, что потом существенно упростило сборку всего генома. Основными ресурсами для физического картирования являются STS-карта, карта политенных хромосом, карта на основе БАК библиотеки (позволяет состыковать фрагменты). Окончательную стыковку и завершение физической карты удалось сделать при черновом секвенировании, на БАК библиотеке было сделано приблизительно полуторакратное перекрытие генома, что позволило закончить полную физическую карту генома дрозофилы.