Вопрос 2:

Транскрипция - первая стадия реализации генетической информации в клетке. В ходе процесса образуются молекулы мРНК,транспортные, рибосомальные

Синтез молекул РНК начинается в определённых последовательностях (сайтах) ДНК, которые называют промоторы, и завершается в терминирующих участках (сайты терминации). Участок ДНК, ограниченный промотором и сайтом терминации, представляет собой единицу транскрипции -транскриптон.  В каждом транскриптоне присутствует неинформативная зона; она содержит специфические последовательности нуклеотидов, с которыми взаимодействуют регуляторные транскрипционные факторы.

Транскрипционые факторы - белки, взаимодействующие с определёнными регуляторными сайтами и ускоряющие или замедляющие процесс транскрипции.

РНК-полимеразы

Биосинтез РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. В ядрах эукариотов обнаружены 3 специализированные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая пре-рРНК; РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК.

А. Стадии транскрипции

В процессе транскрипции различают 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация

Активация промотора происходит с помощью большого белка - ТАТА-фактора, называемого так потому, что он взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора -ТАТААА- (ТАТА-бокс) .

Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Факторы инициации вызывают изменение конформации РНК-полимеразы и обеспечивают раскручивание примерно одного витка спирали ДНК, т.е. образуется транскрипционная вилка,в которой матрица доступна для инициации синтеза цепи РНК .После того как синтезирован олигонуклеотид из 8-10 нуклеотидных остатков, σ-субъединица отделяется от РНК-полимеразы, а вместо неё к молекуле фермента присоединяются несколько факторов элонгации.

Элонгация

Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают расхождение цепей ДНК. Синтез молекулы РНК идёт от 5'- к З'-концу комплементарно матричной цепи ДНК. На стадии элонгации, в области транскрипционной вилки, одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль, около 12 пар нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в направлении от 3'- к 5'-концу впереди неё происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали ДНК.

Терминация

Раскручивание двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его доступным для фактора терминации. Завершается синтез РНК в строго определенных участках матрицы - терминаторах (сайты терминации). Фактор терминации облегчает отделение первичного транскрипта (пре-мРНК), комплементарного матрице, и РНК-полимеразы от матрицы. РНК-полимераза может вступить в следующий цикл транскрипции после присоединения субъединицы σ.

Б. Ковалентная модификация (процессинг) матричной РНК

Первичные транскрипты мРНК, прежде чем будут использованы в ходе синтеза белка, подвергаются ряду ковалентных модификаций. Эти модификации необходимы для функционирования мРНК в качестве матрицы.

Модификация 5'-конца

Модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации. Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидных остатков, происходит кэпирование его 5'-конца. Осуществляет кэпирование гуанилилтрансфераза. Фермент гидролизует макроэргическую связь в молекуле ГТФ и присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5'-фосфатной группой к 5'-концу синтезированного фрагмента РНК с образованием 5', 5'-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием N₇-метилгуанозина завершает формирование кэпа .Модифицированный 5'-конец обеспечивает инициацию трансляции, удлиняет время жизни мРНК, защищая её от действия 5'-экзонуклеаз в цитоплазме. Кэпирование необходимо для инициации синтеза белка, так как инициирующие триплеты AUG, GUG распознаются рибосомой только если присутствует кэп. Наличие кэпа также необходимо для работы сложной ферментной системы, обеспечивающей удаление нитронов.

Модификация 3'-конца

3'-Конец большинства транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, также подвергается модификации, при которой специальным ферментом полиА-полимеразой формируется полиА-последовательность (полиА-"хвост"), состоящая из 100-200 остатков адениловой кислоты. Сигналом к началу полиаденилирования является последовательность -AAUAAA- на растущей цепи РНК. Фермент полиА-полимераза, проявляя экзонуклеазную активность, разрывает 3'-фосфоэфирную связь после появления в цепи РНК специфической последовательности -AAUAAA-. К 3'-концу в точке разрыва полиА-полимераза наращивает по-лиА-"хвост", Наличие полиА-последовательности на 3'-конце облегчает выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме.Ферменты, осуществляющие кэширование и полиаденилирование, избирательно связываются с РНК-полимеразой II, и в отсутствие полимеразы неактивны.

Сплайсинг первичных транскриптов мРНК

С появлением методов, позволяющих изучать первичную структуру молекул мРНК в цитоплазме и последовательность нуклеотидов кодирующей её геномной ДНК, было установлено, что они не комплементарны, а длина гена в несколько раз больше "зрелой" мРНК. Последовательности нуклеотидов, присутствующие в ДНК, но не входящие в состав зрелой мРНК, были названы некодирующими, или интроны, а последовательности, присутствующие в мРНК, - кодирующими, или экзоны. Таким образом, первичный транскрипт - строго комплементарная матрице нуклеиновая кислота (пре-мРНК), содержащая как экзоны, так и интроны. Длина интронов варьирует от 80 до 1000 нуклеотидов. Последовательности интронов "вырезаются" из первичного транскрипта, концы экзонов соединяются друг с другом. Такую модификацию РНК называют "сплайсинг" (от англ, to splice -сращивать). Сплайсинг происходит в ядре, в цитоплазму поступает уже "зрелая" мРНК.

Гены эукариотов содержат больше интронов, чем экзонов, поэтому очень длинные молекулы пре-мРНК (около 5000 нуклеотидов) после сплайсинга превращаются в более короткие молекулы цитоплазматической мРНК (до 3000 нуклеотидов).

Процесс "вырезания" интронов протекает при участии малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП). Нуклеотидные последовательности интронов функционально неактивны. Но на 5'- и З'-концах они имеют высокоспецифические последовательности - AGGU- и GAGG- соответственно (сайты сплайсинга), которые обеспечивают их удаление из молекулы пре-мРНК. Изменение структуры этих последовательностей влияет на процесс сплайсинга.На первой стадии процесса мяРНП связываются со специфическими последовательностями первичного транскрипта (сайты сплайсинга), далее к ним присоединяются другие мяРНП. При формировании структуры сплайсосомы 3'-конец одного экзона сближается с 5'-концом следующего экзона. Сплайсосома катализирует реакцию расщепления 3',5'-фосфодиэфирной связи на границе экзона с интроном. Последовательность интрона удаляется, а два экзона соединяются. Образование 3',5'-фосфодиэфирной связи между двумя экзонами катализируют мяРНК (малые ядерные РНК), входящие в структуру сплайсосомы. В результате сплайсинга из первичных транскриптов мРНК образуются молекулы "зрелой" мРНК.

Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов мРНК

Для некоторых генов описаны альтернативные пути сплайсинга и полиаденилирования одного и того же транскрипта. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в альтернативном пути, поэтому молекулы мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга, различаются набором экзонов. Это приводит к образованию разных мРНК и, соответственно, разных белков с одного первичного транскрипта. Так, в парафолликулярных клетках щитовидной железы (рис. 4-33) в ходе транскрипции гена гормона кальцитонина (см. раздел 11) образуется первичный транскрипт мРНК, который состоит из шести экзонов. Матричная РНК кальцитонина образуется путём сплайсинга первых четырёх экзонов (1-4). Последний (четвёртый) экзон содержит сигнал полиаденилирования (последовательность -AAUAAA-), узнаваемый полиА-полимеразой в парафолликулярных клетках щитовидной железы. Этот же первичный транскрипт в клетках головного мозга в ходе другого (альтернативного) пути сплайсинга превращается в мРНК кальцитонинподобного белка, отвечающего за вкусовое восприятие. Матричная РНК этого белка состоит из первых трёх экзонов, общих с кальцитониновои мРНК, но включает дополнительно пятый и шестой экзоны, не свойственные мРНК кальцитонина. Шестой экзон тоже имеет сигнал полиаденилирования -AAUAAA-, узнаваемый ферментом полиА-полимеразой в клетках нервной ткани. Выбор одного из путей (альтернативный сплайсинг) и одного из возможных сайтов полиаденилирования играет важную роль в тканеспецифической экспрессии генов.

В. Процессинг первичных транскриптов рибосомной РНК и транспортной РНК

Гены, кодирующие большую часть структурных РНК, транскрибируются РНК-полимера-зами I и III. Нуклеиновые кислоты - предшественники рРНК и тРНК - подвергаются в ядре расщеплению и химической модификации (процессингу).

Посттранскрипционные модификации первичного транскрипта тРНК (процессинг тРНК)

Первичный транскрипт тРНК содержит около 100 нуклеотидов, а после процессинга - 70-90 нуклеотидньгх остатков. Посттранскрипционные модификации первичных транскриптов тРНК происходят при участии РНК-аз (рибонуклеаз). Так, формирование 3'-конца тРНК катализирует РНК-аза, представляющая собой 3'-экзонуклеазу, "отрезающую" по одному нук-леотиду, пока не достигнет последовательности -ССА, одинаковой для всех тРНК. Для некоторых тРНК формирование последовательности -ССА на 3'-конце (акцепторный конец) происходит в результате последовательного присоединения этих трёх нуклеотидов. Пре-тРНК содержит всего один интрон, состоящий из 14-16 нуклеотидов. Удаление интрона и сплайсинг приводят к формированию структуры, называемой "антикодон", - триплета нуклеотидов, обеспечивающего взаимодействие тРНК с комплементарным кодоном мРНК в ходе синтеза белков .

Посттранскрипционные модификации (процессинг) первичного транскрипта рРНК. Формирование рибосом

В клетках человека содержится около сотни копий гена рРНК, локализованных группами на пяти хромосомах. Гены рРНК транскрибируются РНК-полимеразой I с образованием идентичных транскриптов. Первичные транскрипты имеют длину около 13 000 нуклеотид-ных остатков (45S рРНК). Прежде чем покинуть ядро в составе рибосомной частицы, молекула 45 S рРНК подвергается процессин-гу, в результате образуется 28S рРНК (около 5000 нуклеотидов), 18S рРНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,88 рРНК (около 160 нуклеотидов), которые являются компонентами рибосом .Рибосома - органелла клетки, участвующая в биосинтезе белка. Рибосома эукариотов (80S) состоит из двух, большой и малой, субъединиц: 60S и 40S. Белки рибосом выполняют структурную, регуляторную и каталитическую функции.

Посттрансляционные модификации полипептидной цепи

Полипептидные цепи могут подвергаться структурным модификациям, либо будучи ещё связанными с рибосомами, либо после завершения синтеза. Эти конформационные и структурные изменения полипептидных цепей получили название посттрансляционных изменений. Они включают удаление части полипептидной цепи, ковалентное присоединение одного или нескольких низкомолекулярных лигандов, приобретение белком нативной конформации.

Многие модификации осуществляются в ЭР. Здесь происходят фолдинг полипептидных цепей и формирование уникальной третичной или четвертичной структуры белков. Причём для поддержания нативной конформации молекул огромное значение имеет правильное формирование дисульфидных связей.

Частичный протеолиз

Многие белки, секретируемые из клеток, первоначально синтезируются в виде молекул-предшественников, функционально неактивных. Удаление части полипептидной цепи специфическими эндопротеазами приводит к образованию активных молекул. Некоторые белки-предшественники расщепляются в ЭР или аппарате Гольджи, другие - после секреции.

Ковалентные модификации.

Структурные белки и ферменты могут активироваться или инактивироваться в результате присоединения различных химических групп: фосфатных, ацильных, метальных, олигосахаридных и некоторых других.

Фосфорилирование белков осуществляется по гидроксильным группам серина, треонина и, реже, тирозина ферментами из группы протеинкиназ, тогда как дефосфорилирование катализируют гидролитические ферменты фосфопротеинфосфатазы .

Гликозилирование. Белки, входящие в состав плазматических мембран или секретирующиеся из клеток, подвергаются гликозилированию. Углеводные цепи присоединяются то гидроксильным группам серина или треонина (О-гликозилирование) либо аспарагина (N-гликозилирование). Последовательное наращивание углеводного фрагмента происходит в ЭР и аппарате Гольджи.

Многочисленным модификациям подвергаются боковые радикалы некоторых аминокислот: в тиреоглобулине йодируются остатки тирозина; в факторах свёртывания крови карбоксилируются остатки глутамата; в ЭР фибробластов гидроксилируются остатки пролина и лизина в цепях тропоколлагена.