22. Реакция иммунофлюоресценции, прямой и непрямой методы. Применение.

Реакция иммунофлюоресценции - РИФ. Различают три разновидности метода прямой, непрямой, с комплементом. Является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью

антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном

микроскопе, как и при прямом методе.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Основным недостатком РИФ является ее субъективность.

23. Иммуноферментный анализ. Ингредиенты, постановка, учёт, оценка. Области применения. Риа.

Радиоиммунный метод, или анализ (РИА), - высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом (125J, 14С, ЗН, 51Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Иммуиоферментный анализ, или метод (ИФА) - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики сальмонеллеза, микоплазмозов и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях-10*10 -10*12 г/л.

Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной - реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена.

Достоинства ИФА: высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации антигена до 10 пг/мл; высокая стандартность и воспроизводимость; возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала; стабильность при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА (до года и более); простота проведения реакции; наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета; возможность автоматизации всех этапов реакции; относительно низкая стоимость диагностических наборов и оборудования.

Применение ИФА: диагностика инфекционных заболеваний: обнаружение антигенов возбудителя; обнаружение антител к антигенам возбудителя; мониторинг заболевания, определение ответа на терапию, прогноза развития заболевания и его исхода; контроль поствакцинального иммунитета; диагностика аутоиммунных заболеваний: определение аутоантител; диагностика аллергических заболеваний: определение общего и специфического IgE; определение продуктов активированных эозинофилов, базофилов и тучных клеток; диагностика злокачественных опухолей: определение в сыворотке маркеров опухолевого роста; фенотипирование опухолевых клеток (тканей) для уточнения происхождения и дифференцировки опухоли; определение концентрации гормонов, параметров менструально-овуляторного цикла; диагностика беременности; определение концентрации лекарственных препаратов; определение допинга; определение загрязнения окружающей среды.