41

ВСТУП

Використання ефекту гетерозису стало основним напрямком селекції кукурудзи і передбачає схрещування двох батьківських форм з високою комбінаційною здатністю. Найбільш поширеним способом забезпечення перехресного запилення у кукурудзи є видалення волотей на материнському компоненті схрещування, що потребує значних витрат ручної праці [28]. Проблема отримання форм з високим рівнем гетерозису при малих витратах – це проблема практичного використання штучних та природних механізмів перехресного запилення.

Сукупність генів, які детермінують розвиток всієї системи ознак генеративних органів і процесу запліднення, а також формування та розвиток насіння, називають генетичною системою розмноження рослин [7]. Спрямоване використання гетерозису передбачає штучну модифікацію генетичної системи розмноження в елементі, який детермінує перехресне запилення – тобто створення генетичної системи контрольованого розмноження. Генетична система контрольованого розмноження (ГСКР) повинна забезпечувати константність генотипів компонентів схрещування та напрямків схрещування [15]. Генетичні системи контрольованого розмноження покладені в основу способів отримання гібридного насіння, що і визначає критерії, яким ці системи повинні відповідати. В першу чергу, це забезпечення винятково перехресного запилення, необхідним критерієм також є забезпечення повноцінного рівня фертильності гібридів першого покоління та відсутність негативного впливу генів, які є компонентами генетичної системи контрольованого розмноження на господарськоцінні ознаки кукурудзи.

Природні механізми ген-залежної цитоплазматичної чоловічої стерильності забезпечують відтворення всіх компонентів генетичної системи контрольованого розмноження [27]. Однак практичне застосування такої системи у виробничих масштабах призводить до уніфікації плазми та виникнення епіфітотій – проблем, що не можуть бути вирішеними в рамках цієї системи. Широке впровадження гібридів, отриманих на основі ЦЧС, призвело до виникнення епіфітотій в США (1971) та СРСР (1989), що змусило повернутися до використання гібридів на фертильній основі, тобто гібридів, отриманих без використання генетичних систем контрольованого розмноження [28]. Розпорядженням Агропромислового комітету Української РСР передбачалось переведення насінництва гібридів на фертильну основу [22, 24].

Альтернативним підходом, який позбавлений вказаних недоліків, є використання функціональної чоловічої стерильності (ФЧС), стерильності, обумовленої зміною генеративних органів без порушення генетичних механізмів мікроспоро- та мікрогаметогенезу. Отже, створення генетичних систем контрольованого розмноження кукурудзи на основі ядерних генів ФЧС є актуальним.

ознаки “зросла волоть”, яка має не повну стерильність Об’єкт дослідження – генетичні системи контрольованого розмноження кукурудзи.

Предмет дослідження – ядерні гени функціональної чоловічої стерильності (ФЧС).

Мета та задачі дослідження. Метою роботи була розробка генетичної системи контрольованого розмноження кукурудзи на основі генів функціональної чоловічої стерильності. В зв’язку з метою досліджень були поставлені такі задачі:

вивчити особливості прояву генів, що детермінують функціональну чоловічу стерильність у зразків генетичної колекції, оцінити їх придатність для використання в генетичних системах контрольованого розмноження кукурудзи;

визначити залежність експресивності генів ФЧС від генетичного фону та умов зовнішнього середовища;

визначити рівень прояву ознаки „стерильність-фертильність” у інбредних ліній кукурудзи та у гетерозисних гібридів з генами функціональної чоловічої стерильності;

дослідити фенотипи рослин при взаємодії генів ФЧС в дигенних комбінаціях і визначити умови та генотипи, що сприяють відновленню фертильності;

визначити наявність плейотропного ефекту генів ФЧС та їх вплив на господарсько-цінні ознаки кукурудзи;

розробити генетичну систему контрольованого розмноження на основі генів ФЧС та способи отримання гібридного насіння.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено генетичну систему контрольованого розмноження кукурудзи на основі генів функціональної чоловічої стерильності, яка включає:

- ген Vg та його домінантний специфічний ген модифікатор Enh(Vg), які детермінують стабільну чоловічу стерильність у інбредних форм кукурудзи;

- гени tk, ad1, Tu, які забезпечують формування пилку у інбредних форм з генотипом VgVg Enh(Vg)Enh(Vg);

- відновлення фертильності у гібридних рослин завдяки високому рівню гетерозиготності.

Розроблена нова генетична система контрольованого розмноження ґрунтується на вперше встановлених автором наступних положеннях:

Експресивність домінантного алеля гена Vg залежить від генетичного фону і не залежить від умов зовнішнього середовища.

Ідентифіковано новий домінантний специфічний ген модифікатор Enhancer(Vg) (Enh(Vg)), який підсилює дію домінантного алеля гена Vg, а саме – детермінує значну редукованість елементів колоску.

Ступінь прояву ознаки „стерильність-фертильність” залежить від рівня гетерозиготності форм з домінантним алелем гена Vg: при однаковій експресивності домінантного алеля гена Vg високий рівень гомозиготність генотипу обумовлює повну чоловічу стерильність, а гетерозиготність сприяє відновленню фертильності.

Ідентифіковано новий рецесивний ген tassel knit (tk), який в гомозиготному стані детермінує деформацію та зростання елементів волоті, що запобігає вивільненню пилку та призводить до функціональної чоловічої стерильності.

В генотипах tktkVg- та ad1ad1Vg- гени мають незалежний прояв. Генотипи tktkVg-, ad1ad1Vg-,Tu- Vg- детермінують морфологічні зміни волоті, при яких умови розвитку частини андроцею близькі до умов розвитку андроцею у рослин дикого типу, що забезпечує формування пилку у рослин з такими генотипами.

У більшості генотипів наявність домінантного алеля гена Vg не призводить до суттєвого зниження висоти рослин, висоти прикріплення качана, насіннєвої продуктивності та вегетаційного періоду. Встановлено зниження рівня збиральної вологості насіння у форм з геном Vg та тривалим вегетаційним періодом в порівнянні з коізогенними формами vgvg.

Практичне значення одержаних результатів. На основі розробленої генетичної системи контрольованого розмноження запропоновано способи отримання гібридного насіння, що ґрунтуються на використанні Vg-стерильних форм (патенти України 40276А, 40277А, 40278А), а також спосіб отримання гібридного насіння на основі гена tk (патент України 56351). Для реалізації цих способів створено аналоги інбредних ліній П346зМVg, П346МVg, П346зСVg, П346СVg, F7зСVg, F7СVg, Гк26зМVg, Гк26МVg, аналоги інбредних ліній цукрової кукурудзи та лінії цукрової кукурудзи з домінантним алелем гена Vg і комплексом господарсько-цінних ознак, які запропоновано використовувати в гібридному насінництві та як донори гена Vg. Запропоновано спосіб селекції кукурудзи на низьку збиральну вологість насіння. Створені аналоги ліній передані в Національний центр генетичних ресурсів рослин України під позначеннями П346зМVg – МП1, П346МVg – МП2, F7зСVg – МП3, F7СVg – МП4, Гк26зМVg – МП5, Гк26МVg – МП6. Ці лінії використовуються в селекційно-насінницький роботі кафедри генетики селекції та насінництва Національного аграрного університету, створені аналоги ліній цукрової кукурудзи Мс-58Vg, Мс-233Vg, Мс-248Vg в секторі біохімічної генетики Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр’єва УААН.

Особистий внесок здобувача. Розробка програми дослідження, проведення досліджень, а також узагальнення результатів дослідження, написання тексту дисертації і формулювання висновків належать авторові.

Апробація роботи. Результати, представлені в дисертації, доповідались на міжнародній конференції студентів та молодих вчених присвяченій 100-річчю генетики “Conference on genetics and molecular biology” (Lviv, 2000), на VII конференції молодих вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття” (Київ, 2000 р.), на першій Всеукраїнській конференції молодих вчених аграріїв “Сучасні агротехнології та біотехнології, насінництво, захист рослин” (Київ, 2000 р.), на міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харків 2001 р.), на міжнародній науково-практичній конференції “Генетические ресурсы культурных растений” (Санкт-Петербург, 2001 р.) на конференції молодих вчених “Актуальні проблеми ботаніки” (смт. Зноб-Новгородське, 2001р.), на VII з`їзді Товариства генетиків та селекціонерів ім. М.І. Вавілова (2002р.), на науковій конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Биоразнообразие, экология, эволюция, адаптация”(Одеса, 2003р.), на ІІ міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харків, 2003 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті, отримано 4 патенти України на винаходи, та опубліковано 7 тез доповідей.

ознака кукурудзи “зросла волоть”було вивчити ознаку “зросла волоть” кукурудзи (ген tk) і можливості його використання. В

• Провести аналіз можливих підходів використання функціональної стерильності у кукурудзи;

• Вивчити морфологічні особливості ознаки зросла волоть;

• Вивчити успадкування ознаки зросла волоть і можливості її використання.

Розділ 1 генетичні системи контрольованого розмноження кукурудзи (огляд літератури)

Сукупність генів, які детермінують розвиток всієї системи ознак генеративних органів та процесу запліднення, а також формування та розвиток насіння, називають генетичною системою розмноження рослин [10]. Використання ефекту гетерозису передбачає модифікацію генетичної системи розмноження в елементі, який детермінує перехресне запилення – тобто створення генетичної системи контрольованого розмноження.

Більшість розроблених для кукурудзи генетичних систем контрольованого розмноження, на яких базуються впроваджені способи отримання гібридного насіння, ґрунтуються на використанні чоловічої стерильності [27], але можливе використання і інших механізмів кросбридингу [20].

У широкому сенсі до явища чоловічої стерильності відносять усі випадки, коли пилок у рослин або зовсім не формується, або виявляється не життєздатним, або розвивається нормально та через різні обставини не може запилити приймочку. Існує декілька класифікацій чоловічої стерильності, які базуються на принципі причинності, успадкування та з урахуванням фенотипових ознак [14, 15]. Виділяють стерильність модифікаційну та спадкову, а спадкову, в свою чергу, поділяють на кілька типів.

Спадкова стерильність – генетично детермінована стерильність, яку обумовлено мутаціями на різних рівнях організації генетичного матеріалу, або еволюційно-відпрацьованими механізмами систем розмноження. Залишаючи поза увагою чоловічу стерильність, що призводить до значних порушень у формуванні геніцею та зниження продуктивності рослин (хромосомна стерильність, тобто відсутність гомології хромосом, або порушення хромосомного балансу, триплоїди і інше), спадкову чоловічу стерильність має сенс поділити за успадкуванням та фенотиповим проявом на такі типи стерильності: цитоплазматична чоловіча стерильність (ЦЧС), ядерна чоловіча стерильність (ЯЧС) та функціональна чоловіча стерильність (ФЧС) (анатомічна).

Генетичні системи контрольованого розмноження на основі чоловічої стерильності повинні включати елементи, які забезпечують стабільний прояв чоловічої стерильності, елементи, що забезпечують відновлення (підтримання) стерильних форм та генетичні механізми відновлення фертильності у гібридів першого покоління.

Генетичні системи контрольованого розмноження на основі детермінантів чоловічої стерильності доцільно умовно поділити на наступні типи. Генетичні системи контрольованого розмноження на основі а) цитоплазматично-ядерних систем; б) ядерних генів чоловічої стерильності; в) генів функціональної чоловічої стерильності.

Цитоплазматична чоловіча стерильність у кукурудзи було описано в 1931р. одночасно двома вченими: М.И. Хаджиновим та М. Родсом [3]. ЦЧС широко вивчається і сьогодні [8, 9, 32]. Сучасні дані по успадкуванню та використанню ЦЧС коротко можна підсумувати таким чином: цитоплазматична чоловіча стерильність обумовлено взаємодією особливого типу (стерильної) цитоплазми та рецесивних алелів ядерних генів (rf). Стерильна цитоплазма позначається символом “S”, фертильна або ж нормальна – “N”. Відомо близько 30 типів та підтипів ЦЧС [32]. У кукурудзи всі типи стерильності за взаємодією з генами ядра та морфо-анатомічними ознаками поділяють на 4 основних типи: Техаський (Т), Молдавський (М) або (S), Парагвайський (С), Болівійський (Б). З цих типів стерильності в основному М та С типи набули розповсюдження у виробництві.

Домінантні алелі ядерних генів Rf відновлюють фертильність пилку при взаємодії їх із стерилізуючою цитоплазмою. Комплементарні гени Rf1 та Rf2, а також Rf^var – відновлювачі фертильності техаського типу ЦЧС; гени Rf4, Rf5, Rf6 – парагвайського типу; ген Rf^var – болівійського типу ЦЧС [2, 3, 10]. У молдавського типу стерильності відновлення фертильності контролюється геном Rf3, який є геном нестійкого домінування, іншими генами меншої сили та додатковими генами [3, 8].

Т тип цитоплазматичної чоловічої стерильності – один з найбільш стабільних типів стерильної цитоплазми, прояв стерильності не залежить від умов навколишнього середовища. Але специфічність будови мітохондріальної мембрани визначає сприятливість до патогенів кількох хвороб [2].

М(S) тип цитоплазматичної чоловічої стерильністі – має найбільшу кількість підтипів. Сиско та ін. на основі вивчення фенотипу пилку та даних про структуру ДНК мітохондрій виділили такі підтипи B/D, CA, LBN, ME, USDA. Підгрупи мають різну ступінь прояву стерильності, навіть при однаковому генетичному фоні. Так, підгрупи B/D, CA характеризуються найбільшим проявом фертильності, а підгрупа LBN визначає найбільший прояв чоловічої стерильності[32].

С тип цитоплазматичної чоловічої стерильностї – за фенотиповим проявом та ядерним контролем близький до техаського. Виділяють п’ять підгруп за поліморфізмом ДНК мітохондрій: C, PR, Bd, ES, RB. Підгрупа ES має найбільший прояв стерильності.

Широко використовується генетична система контрольованого розмноження кукурудзи на основі цитоплазматичної чоловічої стерильності та генів відновлення фертильності. Детермінантом чоловічої стерильності виступає стерилізуюча плазма, її реалізація відбувається при наявності в генотипі рецесивних алелів генів відновлення фертильності, тобто наведений ідіотип формує стерильний фенотип. Явище ядерного контролю стерильності дозволяє сформувати підтримуючий ідіотип, який містить нормальну (фертильну) плазму та рецесивні алелі генів відновлення фертильності. Запилення рослин з ідіотипом S rfrf підтримуючою формою призводить до формування насіння із стерильною плазмою та рецесивними алелями генів відновлення фертильності.

Компонент відновлення фертильності в даній генетичній системі контрольованого розмноження кукурудзи включає домінантні алелі генів закріплення відновлення із стерильною або фертильною плазмами. Стерильні рослини схрещуються з рослинами, які містять компонент відновлення (домінантні алелі генів відновлення фертильності). Від такого схрещування в наступній генерації отримують ідіотип, який містить стерильну плазму та має гетерозиготність за генами відновлення фертильності. Наявність домінантних алелів забезпечує фертильність рослин з таким ідіотипом.

Практичне застосування генетичної системи контрольованого розмноження на основі цитоплазматичної чоловічої стерильністі може бути здійснене і при відсутності компонента, який забезпечує відновлення фертильності, але такий шлях передбачає сумісний посів гібридів першого покоління із фертильними рослинами того ж гібриду [12].

Явище цитоплазматичної чоловічої стерильності та ядерний контроль реалізації плазмогенів є вихідними моментами для створення всіх компонентів генетичної системи контрольованого розмноження, однак реалізація цієї системи пов’язана з труднощами практичного характеру, які викликані модифікаційною та спадковою мінливістю. Прояв стерильності, яка загущених посівах значно знижується відсоток появи фертильних рослин. Ознака „стерильність-фертильність” залежить також від застосування добрив, району вирощування, погодних умов. М та С типи стерильності обумовлена цитоплазмою та генами відновлення фертильності у кукурудзи залежить від багатьох факторів навколишнього середовища. Так, при стерильності характеризується нестійким проявом ознаки „стерильність-фертильність” і, за несприятливих погодних умов, з’являються фертильні рослини . Особливо нестійкий прояв ознаки цитоплазматичної чоловічої стерильністі у рослин з молдавським типом стерильності [8, 10, 19]. На цьому типі стерильності створено та практично реалізовано генетичну систему контрольованого розмноження для більшості вітчизняних гібридів.

Одним з недоліків генетичної системи контрольованого розмноження є полігенна детермінація ознаки „стерильність-фертильність”, яка спричиняє низку незручностей для створення ліній з достатнім вираженням ознаки “стерильність”, “закріплення стерильності” та “відновлення фертильності”, оскільки генетична система контрольованого розмноження реалізується для кожного нового гібриду і має свої відмінності (наявність генів-модифікаторів) [10]. Показано, що у деяких підтипів молдавського типу цитоплазматичної чоловічої стерильності відбувається реверсія до дикого типу [2]. В літературі існує припущення про можливість успадкування плазмогенів від батьківської форми [27].

Є відомості про дещо нижчу (2–4 %) врожайність гібридів з відновленою фертильністю в порівнянні з аналогічними гібридами, але отриманих на нормальній цитоплазмі [12, 27].

Одним з основних недоліків генетичної системи контрольованого розмноження на основі ЦЧС та генів відновлення фертильності є враженість рослин із стерильною плазмою хворобами. Особливо у форм з плазмою техаського типу ЦЧС, які уражуються гельмінтоспоріозом раси Т (Bipolaris (Helminthosporium) maydis T) та жовтою листовою гниллю (Phyllostica sp.). Не позбавлений цієї вади і С тип стерильності. Був виявлений специфічний вид Bipolaris maydis, який проявив високу вірулентність відносно рослин з С типом ЦЧС [39]. Виходячи з існування специфічних рас збудників для Т та С типу стерильності у кукурудзи, а також для форм з ЦЧС інших культур, можна передбачити існування специфічних патогенів для інших типів ЦЧС кукурудзи.

Виникнення епіфітотій внаслідок уніфікації плазми вирощуваних гібридів стало причиною відмови від практичного використання генетичних систем контрольованого розмноження на основі ЦЧС та генів відновлення фертильності [11, 19].

Проблема виникнення епіфітотій – це не тільки проблема використання генетичних систем контрольованого розмноження на основі сприятливих до ураження типів плазми, а й проблема використання плазматичних детермінантів стерильності взагалі.

Відомо і інші системи:

• Генетиична система контрольованого розмноження кукурудзи на основі ядерних генів чоловічої стерильності.

Шляхом вирішення проблеми уніфікації плазми є використання систем контрольованого розмноження на основі ядерних детермінантів чоловічої стерильності.

Як правило, ядерна стерильність – рецесивна та моногенна, тому основною проблемою при створенні генетичних систем контрольованого розмноження є підтримання стерильних форм. Простим і найбільш доцільним шляхом є запилення стерильних гомозиготних рослин фертильними по пилку гетерозиготними за геном чоловічої стерильності рослинами.

• Можливість використання вибірковості запліднення в генетичних системах контрольованого розмноження кукурудзи.

Принципово інша система контрольованого розмноження кукурудзи може бути сформована на основі явища вибірковості запліднення.

• Генетична система контрольованого розмноження кукурудзи на основі експериментальної дводомності.

У кукурудзи відомо кілька генів, що спричиняють відсутність пилку без порушення механізмів утворення гамет. Наприклад, деякі гени змінюють напрямок формування квіток. Квітки на обох суцвіттях потенційно двостатеві. На ранніх етапах розвитку суцвіть відбувається диференціація квітки і у відповідності до напрямку розвитку – деградація андроцею або геніцею [34, 16].

• Нові генетичні системи контрольованого розмноження створені з використанням методів генетичної інженерії

Методи генетичної інженерії відкривають необмежені можливості при формуванні генетичних систем контрольованого розмноження. Такі системи можуть базуватися як на нових принципах, так і на вже відомих [17]. Привнесення в геном рослин чужинних генів часто викликає зниження чоловічої та жіночої фертильності.

Завершуючи огляд літератури, необхідно сказати, що більшість розроблених на сьогодні генетичних систем контрольованого розмноження кукурудзи ґрунтуються на використанні детермінантів чоловічої стерильності,

тому вивчення ознаки “зросла волоть”, яка детермінує функціональну чоловічу стерильність – є важливим завданням.