Лабораторная работа №4 анализ качества осахаривающих материалов. Часть II

Цель работы: изучить требования, предъявляемые к осахаривающим материалам, используемым в спиртовой промышленности; освоить модифицированный фотоэлектроколориметрический метод определения амилолитической активности ферментных препаратов.

Аппаратура и реактивы:

- фотоэлектроколориметр;

- водяная баня, лабораторная посуда, пипетки;

- 2 %-ный раствор крахмала;

- буферные растворы ацетатный, рН 4,7;

- 0,1 н раствор соляной кислоты;

- основной раствор йода;

- рабочий раствор йода, дистиллированная вода;

- амилолитические ферментные препараты.

Задание 1 Определить α-амилазную активность ферментных препаратов модифицированный фотоколориметрическим методом

Метод разработан К. М. Бендецким и Е. С. Павловой под руководством В. Л. Яровенко во ВНИИ пищевой биотехнологии (ВНИИПБТ). Он основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза крахмала, которую устанавливают по глубине превращения крахмала под действием фермента с применением колориметрической реак­ции крахмала с йодом. Глубину превращения крахмала по полученным данным определяют отношением подвергшихся гидролизу α-амилазой гликозидных связей к первоначальному числу этих связей в субстрате до гидролиза.

За единицу активности а-амилазы принимают такое количество фермента, которое катализирует расщепление за 1 мин при рН 4,7 и температуре 30° С 1 мкмоль гликозидных связей в растворимом крах­мале при начальной его концентрации в инкубационной среде 1%.

Реактивы:

- 1 н ацетатный буфер с рН 4,7;

- 0,1 н раствор соля­ной кислоты;

- рабочий раствор йода.

Подготовка к анализу:

В качестве субстрата используют 2 %-ный раствор крахмала. 2 г растворимого крахмала с учетом влажности по­мещают в мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 50 см³ дис­тиллированной воды, помещают колбу с содержимым в кипящую водя­ную баню и выдерживают при непрерывном перемешивании до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, до­бавляют 20 см³ 1 н ацетатного буфера и доводят объем до метки дис­тиллированной водой при 20° С. Раствор крахмала готовят в день про­ведения анализа.

Проведение анализа:

Берут две пробирки, наливают в каждую по 5 см³ субстрата и ставят в ультратермостат с температурой 30±0,2 ⁰С. Пробирки с содержимым выдерживают при этой температуре 10 мин. Одновременно прогревают при данной температуре ферментный рас­твор и дистиллированную воду. Затем в одну пробирку вносят 5 см³ дистиллированной воды (контрольная проба), в другую - 5 см³ фер­ментного раствора (опытная проба). Смеси быстро перемешивают и удерживают в ультратермостате при температуре 30+0,2° С в течение 10 и 20 мин. Через 10 и затем через 20 мин из реакционных смесей отбирают по 0,5 см³ раствора и переносят в колбы, куда предварительно наливают по 50 см³ рабочего раствора йода. Реакционные смеси выдерживают 20 мин при комнатной температуре, после чего измеряют оптическую плотность окрашенных растворов (опытного и контрольного) на электроколориметре в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя красный светофильтр (длина волны = 650 нм).

Получают ряд значений оптической плотности A_t опытных раство­ров определяемых через 10 и 20 мин (A₁₀ и A₂₀), а также контрольных растворов при этих температурах (A_k).

Обработка результатов

α-Амилазную активность рассчитывают по формуле:

АС = , (4.1)

где A_t и А_к - оптическая плотность ислледуемого и контрольного растворов;

а - содержание ферментного препарата в реакционной среде, г/см³;

t – время инкубации, мин;

4,11 - постоянный коэффициент.

Пример. На анализ взят спиртоосажденный препарат культу A.awamori. Готовят его раствор - 0,1 г на 100 см³ дистиллированн воды. Затем разбавляют в 10 раз. Отбирают 5 см³ для проведения ферментативной реакции с 5 см³ субстрата. В 1 см³ реакционной среды держится препарата а = 5·10^-5 г (0,1·1·5/100·10·10).

После проведения реакции с йодом были получены следующие значения оптических плотностей: А₁₀ = 0,700, А₂₀ = 0,520, А_к = 0,9 Подставляя полученные значения в формулу, можно рассчитать амилолитическую активность исследуемого препарата:

АС₁ = = 1200,9 ед/г;

АС₂ = = 1147,5 ед/г.

АС₁ и АС₂ - значения декстриногенной активности, вычисленые по данным, полученным за 10 и 20 мин инкубации, близки по величине (1200,9 и 1147,5). Среднее значение их составляет 1174 ед/г. Расхождение от средних значений ±2,69%, что говорит о том, что анализ проведен правильно. Для оценки исследуемого препарата используются средние данные.

Задание 3 Сделать выводы по проделанной работе, ответить на контрольные вопросы

Вопросы для контроля:

1. Расскажите методику определения амилолитической активности модифицированным фотоэлектроколориметрическим методом.