Секвенирование днк [править]
Основная статья: Секвенирование
В методе секвенирования с использованием меченных флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченные флуоресцентной или радиоактивной меткой. Присоединение дидезоксинуклеотида к синтезируемой цепи приводит к обрыву синтеза, позволяя определить положение специфических нуклеотидов после разделения в геле.
Мутагенез [править]
Основная статья: Мутагенез
В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза (внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК). Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.
15Система рестрикции-модификации
[править]
Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Эндонуклеаза EcoRV в комплексе с расщепленным фрагментом ДНК.
Система рестрикции-модификации — ферментативная система бактерий, разрушающая попавшую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция — защита клетки от чужеродного генетического материала, например, бактериофагов и плазмид. Для компонентов системы характерны два типа активности — метилтрансферазная (метилазная) и эндонуклеазная. За каждую из них могут отвечать как отдельныебелки, так и один белок, сочетающий в себе обе функции.[1]
Система рестрикции-модификации (СР-М) специфична по отношению к определённым последовательностям нуклеотидов в ДНК, называемых сайтами рестрикции. Если определённые нуклеотиды в последовательности не метилированы, эндонуклеаза рестрикциивносит в ДНК двуцепочечный разрыв (часто — со смещением на несколько нуклеотидов между цепями), при этом биологическая роль молекулы ДНК нарушается. В случае, когда метилирована только одна из цепей ДНК, расщепления не происходит, вместо этого метилтрансфераза добавляет метильные группы к нуклеотидам второй цепи. Подобная специфичность СР-М позволяет бактериям проводить селективное расщепление чужеродной ДНК, не затрагивая собственную. В норме вся ДНК в бактериальной клетке либо полностью метилирована, либо полностью метилирована только по одной цепи (сразу после репликации). Напротив, чужеродная ДНК не метилирована и подвергается гидролизу.[1]
Содержание [убрать]
|
История открытия [править]
Системы рестрикции-модификации были открыты в результате изучения молекулярных механизмов явления, называемого «ограничение, контролируемое хозяином» (англ. host-controlled restriction) или «рестрикция». Суть явления заключается в том, что бактериофаги, выделенные из клеток одного штамма бактерий, очень плохо размножаются в другом. При инфицировании вирусными частицами, выделенными из второго штамма, клеток первого опять наблюдается подавление размножения фага, в то время как во втором штамме они репродуцируются нормально. Таким образом, у бактерий наблюдается система подавления размножения бактериофагов. Вирусы, которые все же смогли её преодолеть, приобретают устойчивость к действию этой системы. С. Лурия и M.L. Human в своей статье 1952 года[2] писали:
Анализируя соотношение между определёнными фагами и определёнными мутантами их бактерий-хозяев, мы столкнулись с новым феноменом: генотип хозяина, в котором размножается вирус, влияет на фенотип новых вирусов. Фенотипические изменения подавляют способность вируса размножаться в определённых штаммах. Это непостоянное изменение, один успешный цикл размножения в подходящем хозяине возвращает вирус в исходную форму.
Оригинальный текст (англ.) [показать]
Схема эксперимента, демонстрирующего явление «ограничения, контролируемого хозяином».
Впоследствии было показано, что бактериофаги, выделенные из разных штаммов, имеют одинаковый генотип, но разную картину метилирования ДНК, соответствующую специфичности СР-М данного штамма.[3]
В 1978 году Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине «За обнаружение рестрикционных ферментов и их применение в молекулярной генетике».