3. Автономные методы анализа

В этом разделе мы рассмотрим принципы работы некоторых аналитических методов определения свойств культуральных жидкостей, биокатализаторов и биосорбентов. Вообще говоря, для этой цели можно использовать любые методы аналитической химии, спектроскопии и биохимии; очевидно, что в настоящем пособии не представляется возможным дать сколько-нибудь полное описание этой темы. Поэтому мы сосредоточим внимание на некоторых новых методах определения тех свойств клеток, которые наиболее важны для контроля микробиологических процессов и управления ими, а также рассмотрим другие наиболее часто применяемые методы анализа.

3.1. Определение свойств среды

Первая стадия обработки пробы, отобранной из биореактора или аппарата, где происходит разделение продуктов, обычно заключается в отделении твердой фазы (клеток или любых других нерастворимых компонентов) от жидкой путем фильтрования или центрифугирования. Применение затем той или иной конкретной аналитической методики зависит от природы изучаемого материала и цели анализа. Действительно, методы анализа, пригодные для изучения синтетической среды, могут оказаться неточными или вообще неприменимыми в случае сложной среды неопределенного состава, которая может содержать мешающие ходу анализа вещества.

Из параметров находящейся в биореакторе системы обычно наибольший интерес представляют концентрации субстратов и других компонентов, влияющих на скорости реакций, а также концентрации продуктов реакции и ингибиторов. В микробиологических процессах часто желательно также определять содержание источников углерода и азота, а иногда и ряда ионов, например ионов магния или фосфатного иона. По свойствам и степени сложности химической структуры продукты жизнедеятельности клеток могут варьировать в очень широких пределах, например, от этанола до гораздо более сложных соединений типа пенициллина и биологических макромолекулярных веществ типа ферментов и других белков. Соответственно и методы анализа продуктов микробиологических процессов очень разнообразны.

Для количественного определения компонентов жидкой фазы обычно применяют методы, основанные на измерении показателя преломления с помощью рефрактометрических детекторов, поглощения света при определенной длине волны с помощью спектрофотометра или флуоресценции (после возбуждения при одной длине волны и последующей эмиссии при больших длинах волн) с помощью спектрофлуорометра. Сахара, например, практически не поглощают свет и не флуоресцируют, но влияют на показатель преломления раствора. С другой стороны, белки и нуклеиновые кислоты удобно определять спектрофотометрическим и спектрофлуорометрическим методами. Последний метод обычно более чувствителен и позволяет определять более низкие концентрации веществ, однако спектрофлуорометры намного дороже спектрофотометров, поэтому спектрофотометрия остается одним из самых распространенных и популярных методов. Чтобы устранить помехи со стороны других растворенных веществ, часто приходится прибегать к операциям концентрирования или отделения определяемого соединения от других растворенных веществ. Иногда отделение удается осуществить путем химической обработки, в результате которой мешающие вещества разрушаются или осаждаются. Так, например, РНК экстрагируют из лизатов клеток перхлорной кислотой HClO₄ при 37 °C и определяют с помощью орсина (специфического реагента на рибозу). Мешающие определению сахара отделяются в процессе экстракции.

В ходе изучения химического состава среды обычно применяют и более тонкие методы разделения близких по химической природе веществ, например хроматографические. Хроматографические методы разделения основаны на селективном удерживании некоторых соединений неподвижной фазой, находящейся в колонке. Селективность удерживания обеспечивается предпочтительным сродством по отношению к неподвижной фазе одних веществ по сравнению с другими. Так, при анализе смесей сахаров (например, мальтозы и глюкозы) применяют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в котором разделение достигается за счет различного сродства этих двух углеводов к первичным аминогруппам на поверхности носителя (неподвижной фазы), содержащегося в обычной выпускаемой серийно колонке. Различные сахара вымываются с колонки в разное время; их можно обнаружить и определить количественно с помощью рефрактометрического детектора. Метод ВЭЖХ применяется и для определения многих других компонентов среды. Помимо ВЭЖХ для разделения смесей близких веществ используют ионообменную и эксклюзионную хроматографию (в отличие от ВЭЖХ в этих хроматографических методах разделение осуществляется при атмосферном или слегка повышенном давлении) с последующим количественным определением индивидуальных компонентов среды.

Как мы уже отмечали, полезным методическим приемом органического анализа является селективное превращение определяемых соединений в производные, легко поддающиеся непосредственному определению. На этом принципе основан один из стандартных лабораторных методов определения глюкозы, в котором ферменты глюкозооксидаза и пероксидаза селективно превращают глюкозу в окрашенное соединение, концентрацию которого определяют спектрофотометрически.

В последние годы для определения ряда биологически важных ионов широко применяют ионоселективные электроды. Так, азотсодержащие клеточные вещества можно определять с помощью NH₃-электрода непосредственно (NH₃, а после соответствующего изменения рН также NH₄⁺) после восстановления (NO^2-, NO^3-) или после обработки ферментами (аминокислоты, мочевина). Разработаны ионоселективные электроды для определения многих других ионов, влияющих на биохимические структуры и их функции, в том числе K⁺, Na⁺, Са²⁺.

Иногда концентрацию того или иного вещества в растворе определяют путем измерения его биологической активности. Именно таким способом обычно определяют, например, концентрацию пенициллина в культуральной жидкости при производстве этого антибиотика. Здесь мерой активности пенициллина в растворе является размер зоны погибших бактерий, окружающей пористый диск, пропитанный изучаемым раствором. Содержание ферментов в подавляющем большинстве случаев определяют путем измерения их активности. Для этой цели раствор пробы обрабатывают стандартным субстратом в стандартных условиях с последующим измерением скорости исчезновения субстрата или образования продукта реакции; соответствующие измерения часто осуществляют спектрофотометрическим или спектрофлуорометрическим методами.

Другой подход к анализу биологически важных веществ основан на их переведении в газовую фазу и последующем определении. Глюкозу, например, превращают в триметилсилильное (ТМС) производное, которое затем переводят в газовую фазу в системе ввода газового хроматографа, а потом определяют с помощью пламенно-ионизационного детектора. Понятно, что таким же путем без модификации изучаемых веществ можно определять содержание в культуральной жидкости относительно летучих компонентов, например этанола, ацетона и бутанола.

В аналитических лабораториях при пилотных и крупномасштабных промышленных ферментерах часто имеется один или несколько автоанализаторов для проведения мокрого химического анализа, где автоматически осуществляются операции экстракции, разведения и определения нескольких веществ. Время выполнения анализов составляет 10—30 мин, что во многих случаях вполне достаточно для успешного контроля за ходом процессов в биореакторе.