8.1. Культивирование животных клеток; требования к среде

По сравнению с микроорганизмами для культивирования животных клеток требуются более сложные и дорогие среды. Обычно для предотвращения заражения в среду вводят антибиотики. В состав большинства сред входит сыворотка животных в концентрации 5—20%, которая способствует репликации клеток. Известны и другие (но далеко не все) функции, выполняемые сывороткой в среде для роста животных клеток. Сыворотка обеспечивает возможность применения данной среды для роста животных клеток различных типов, которые требуют различных питательных веществ и факторов роста. Показано, что потребность в питательных веществах может зависеть от условий культивирования; в некоторых случаях применение очень богатой и высококонцентрированной среды в какой-то степени компенсирует отсутствие точных данных о необходимости определенных компонентов. По не вполне понятным пока причинам клетки, выросшие в среде с более высоким содержанием сыворотки, часто оказываются более устойчивыми к механическим повреждениям.

Вместе с тем использование сыворотки для культивирования животных клеток не свободно от ряда проблем, важнейшей из которых является высокая стоимость сыворотки; это особенно сильно сказывается на общей стоимости крупномасштабных процессов. Так, например, если содержание сыворотки в среде составляет 10%, то затраты на сыворотку стоимостью до 300 долларов за литр составляют 80% общих материальных затрат. Сыворотка, кроме того, представляет собой главный источник заражения культуры вирусами, микоплазмой (паразитными или патогенными грамотрицательными прокариотами) и бактериями. Она может содержать ингибиторы, затрудняющие репликацию вирусов (в производстве вакцин) или биосинтез ферментов. Как и сложные природные компоненты сред для роста микроорганизмов, сыворотка представляет собой компонент непостоянного и отчасти непредсказуемого состава. Наконец, вместе с сывороткой в среду поступают пирогенные (вызывающие лихорадку) вещества, затрудняющие выделение продукта. Содержащийся в сыворотке фоновый белок альбумин также затрудняет выделение белков, синтезируемых в небольших количествах; именно по этой причине для облегчения выделения продукта (например, моноклональных антител) иногда прибегают к бессывороточным средам.

На рис. 40 представлена схема недавно предложенного иного подхода к снижению стоимости сложных компонентов среды. В этом методе цельную лимфу живой коровы фильтруют и вводят в камеру клеточного роста, где лимфа через полупроницаемые полые волокна контактирует с клетками. На рисунке указано также положение устройств для введения других компонентов среды и газообмена.

РИС. 40. Культивирование клеток с применением в качестве одного из компонентов среды профильтрованной лимфы крупного рогатого скота.

Большие успехи достигнуты в создании бессывороточных сред определенного гормонального состава. К потенциальным преимуществам таких сред относятся возможность регулирования состава среды в соответствии с особенностями клеток данного типа и условий культивирования, снижение опасности заражения, лучшая воспроизводимость результатов. С другой стороны, подобные среды определенного состава имеют более высокую стоимость и к тому же могут оказывать то или иное воздействие на организмы, которое проявляется лишь спустя некоторое время и которое трудно предвидеть заранее или обнаружить в ходе сравнительно кратковременных экспериментов по подбору состава среды.

Животные клетки не имеют типичных для микроорганизмов клеточных стенок, обеспечивающих механическую прочность; кроме того, животные клетки обычно значительно крупнее клеток микроорганизмов. Поэтому на любое механическое воздействие на культуру животных клеток (перемешивание суспензии клеток или частиц носителей, содержащих клетки на поверхности или во всем объеме, с целью поддержания однородности реакционной массы или ускорения переноса кислорода к клеткам) должны налагаться определенные ограничения. Для культур животных клеток концентрация кислорода должна составлять приблизительно 25—40% от концентрации кислорода в насыщенной воздухом системе, поэтому проектирование систем подачи кислорода в большой объем культуры животных клеток всегда представляет собой сложную инженерную проблему. Жесткие требования, предъявляемые к насыщению системы кислородом, могут быть несколько смягчены благодаря низким скоростям роста животных клеток и протеканию метаболических процессов в клетках.

При типичной плотности культуры, составляющей 10⁶ клеток в 1 мл, потребность в кислороде составляет 0,05—0,6 ммоль О₂ на литр культуры в час. В небольших сосудах, обычных для лабораторных экспериментов, потребность в кислороде может быть удовлетворена за счет диффузии кислорода из газовой смеси, находящейся над поверхностью жидкости, в жидкую фазу. При переходе к реакторам большего объема такой механизм переноса кислорода уже не может обеспечить потребность культуры в кислороде. Иногда в таких случаях с успехом применяется прямой барботаж газа в жидкую фазу. В других ситуациях непосредственный барботаж повреждает клетки и может вызвать интенсивное пенообразование, особенно если в состав среды входит значительное количество сыворотки. Для насыщения культуры животных клеток кислородом предлагался и другой метод, заключающийся во введении в культуру силиконовых трубок, через стенки которых кислород диффундирует в среду, не образуя пузырьков. Общий коэффициент массопередачи кислорода через стенку силиконовой трубки составляет около 0,35 ммоль 02/(атм·см²·ч); по этой величине можно рассчитать необходимое количество трубок. По мере увеличения масштаба процесса возможность обеспечения культуры кислородом с помощью силиконовых трубок становится все более и более проблематичной.

В относительно хорошо отработанных технологических процессах с участием культур животных клеток рН культуры постоянно контролируется и поддерживается на постоянном уровне, обычно около 7,0. К настоящему времени накоплен лишь очень небольшой опыт работы с культурами животных клеток в реакторах, снабженных всеми необходимыми контрольно-измерительными приборами, обеспечивающими получение наиболее полного набора аналитических данных и самые разнообразные методы контроля. Как мы увидим в следующей главе, многие контрольно-измерительные приборы и методы, которые находят применение при работе микробиологических реакторов, в будущем можно будет использовать и для оптимизации работы реакторов с культурами животных клеток.

Регулирование рН культуры клеток осуществляется несколькими способами. Введение в состав среды компонентов с буферными свойствами может сглаживать флуктуации рН, часто обусловленные продуцируемой клетками молочной кислотой. Величиной рН среды можно также управлять путем изменения концентрации СО₂ в газовой фазе, находящейся в контакте с культурой. Другим методом регулирования рН является непосредственное добавление основания. Флуктуации рН в реакторах могут быть сглажены и путем постоянной или периодической замены среды в реакторе на свежую.