Лабораторная работа №8

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ ПО СИСТЕМЕ АВ0 и Rh

Теоретические сведения

В основе определения групповой принадлежности крови лежит реакция изогемагглютинации, т. е. реакция агглютинации элемен­тов крови человека.

Реакция агглютинации представляет собой взаимодействие ан­тигена с антителом.

Антигены (агглютиногены) А и В, определяющие групповую принадлежность человека, находятся на эритроцитах. В сыворотке крови содержатся два соответствующих антитела (агглютинина) — α и β. При встрече агглютиногена А с агглютинином а и агглютиногена В с агглютинином b происходит реакция агглютинации.

Таким образом, существует четыре допустимых комбинации; то, какая из них характерна для данного человека, определяет его группу крови:

α и β: первая (0)

A и β: вторая (A)

α и B: третья (B)

A и B: четвёртая (AB)

Условия определения. Определение групповой принадлежности производят с помощью стандартных сывороток. Стандартными сы­воротками называются сыворотки точно известной группы крови, обладающие высоким титром.

При определении группы крови по стандартным сывороткам пользуются обязательно двумя различными сериями.

Можно производить определение групп крови перекрестным ме­тодом: одновременно при помощи стандартных сывороток и стан­дартных эритроцитов. Стандартными эритроцитами называются эри­троциты точно известной группы крови, обладающей хорошей агглютинабельностью.

Определение групп крови у новорожденных следует произво­дить только по стандартным сывороткам, так как в сыворотке но­ворожденных агглютинины в ряде случаев не выявляются.

Определение группы крови необходимо производить при тем­пературе не ниже 15° и не выше 25°, при достаточном освещении на плоской белой матовой (непрозрачной) поверхности.

Посуда и оборудование.

1. Тарелки или белые пластинки со смачиваемой поверхностью.

2. Песочные часы на 5 минут.

3. Стеклянные палочки.

4. Пипетки (для стандартных сывороток и физиологического раствора).

5. Карандаши по стеклу.

6. Небольшие штативы с 4 или 7 гнездами.

7. Скарификаторы со съемными иглами.

8. Вата.

9.Пастеровские пипетки для стандартных эритроцитов.

Реактивы.

1. Физиологический раствор.

2. Стандартные сыворотки 0(I), А(II) и B(III) и в случае не­ обходимости AB(IV) групп с титром не ниже 1:32. Сыворотки хранят в холодильнике при 4-8 °С. Вскрытые ампулы могут хра­ниться в течение 5-6 дней, закрытые ватной пробкой. Стандарт­ные сыворотки пригодны для работы в течение указанного на них срока. Использование сыворотки с истекшим сроком годности допускается только после проверки ее титра.

3. Стандартные эритроциты О, А и В групп.

Кровь для приготовления стандартных эритроцитов можно брать из пальца. В агглютинационную пробирку отмеривают 4-5 капель 4-5% раствора цитрата натрия и в 4 раза большее коли­чество крови (каплю крови снимают краем пробирки). При взятии пробирку все время встряхивают, чтобы не образовалось сгустка. Цитратную кровь центрофугируют, плазму отсасывают, а вместо нее наливают физиологический раствор и вновь центрифугируют. Хранят стандартные эритроциты в холодильнике при температуре 5-8°. Перед употреблением физиологический раствор отсасывают пипеткой.

Определение группы крови при помощи стандартных сывороток

Тарелку или белую пластику делят на квадраты. Сверху каж­дого квадрата надписывают группу крови: 0(I), А(II) и В(III). Слева пишут фамилию исследуемого лица. В квадраты соответ­ственно надписям наносят по крупной капле стандартной сыворот­ки двух серий каждой группы в два ряда и рядом с каждой кап­лей сыворотки концом стеклянной палочки наносят приблизитель­но в 10 раз меньшую каплю крови, взятую из пальца исследуемого лица. Нанесенные капли смешивают стеклянными палочками или углами предметного стекла. Можно смешивать капли и одной па­лочкой, но в этом случае необходимо после каждого смешивания промыть ее в стакане с водой и хорошо высушить.

С момента смешивания капель отмечают время. Наблюдение ведут в течение 5 минут. Тарелку периодически медленно покачи­вают. На 4-ой минуте к каждой капле крови, в которой наступила агглютинация, добавляют каплю физиологического раствора и сно­ва покачивают пластинку. По истечении 5 минут отмечают ре­зультат.

Интерпретация. Наличие в капле мелкой зернистости или круп­ных хлопьев наблюдается при агглютинации.

В случае отсутствия агглютинации видна равномерно окрашен­ная гомогенная жидкость.

0(I) группа крови характеризуется отсутствием агглютинации во всех каплях.

Если агглютинация обнаружена со стандартной сывороткой 0αβ(I) и Bα(III) групп и не наступила со стандартной сывороткой Аβ(II) группы, то исследуемые эритроциты содержат агглготиноген А и принадлежат к А(II) группе.

Если агглютинация наступила со стандартной сывороткой 0αβ(I) и Аβ(II) групп и не обнаружена с сывороткой Bα(III) группы, то исследуемые эритроциты содержат агглютиноген В и принадлежат к В(III) группе. Если все три сыворотки дали аг­глютинацию, то возможно, что исследуемая кровь AB(IV) груп­пы. Однако для исключения неспецифической агглютинабельности исследуемых эритроцитов исследование повторяют с сывороткой ABO(IV) группы. Отсутствие агглютинации в этой капле при на­личии ее в каплях, содержащих сыворотку 0αβ(I), Аβ(II) и Bα(III) групп, подтверждает AB(IV) группу исследуемой крови. Результаты принимаются как истинные при совпадении их в обеих сериях стандартных сывороток.

При оценке результатов реакции возможны ошибки:

1. Ложная агглютинация.

Краевая агглютинация может наблюдаться при подсыхании капли, если определение ве­дется дольше положенного времени.

Холодовая агглютинация наступает, если определение проводится при температуре ниже 15°. При добавлении подогретого до комнатной температуры физиологического раствора агглютина­ция уничтожается.

Эритроциты могут также складываться в «монетные столбики», если тарелка не покачивалась. Прибавление физиологического раствора уничтожает «монетные столбики».

Бактериальная агглютинация – скучивание эритроцитов вокруг бактерий – может наблюдаться при прорастании крови или стандартных сывороток.

2. Агглютинация может не наступить там, где она должна быть, вследствие: 1) неправильного количественного соотношения между исследуемой кровью и стандартной сывороткой; 2) слабого титра стандартных сывороток; 3) гемолиза эритроцитов исследуемого, слабой агглютинабельностью исследуемых эритроцитов при наличии в эритроцитах слабого агглютиногена А; 4) определения при высокой температуре окружающего воздуха и в случае определения менее 5 минут.